酿酒酵母中snare蛋白sec20影响细胞自噬的研究
：细胞自噬是真核生物体中一种高度保守的物质降解途径，其在生物体的生长发育、 免疫防御等多方面有着非常重要的作用。SNARE蛋白在细胞囊泡运输过程中具有重要作用，近年研究发现部分SNARE蛋白同时调控细胞自噬过程。本课题以SNARE蛋白Sec20为研究对象，发现Sec20不仅参与COPI囊泡与内质网的融合，同时影响细胞自噬的正常运输。本研究利用荧光观察及蛋白印迹技术，发现GFP-Atg8在sec20ts不能被正常运输到液泡降解，但突变体中回补SEC20后，GFP-Atg8的运输过程恢复正常。研究结果为进一步阐明细胞自噬的分子机制中的功能提供实验依据。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1.1酿酒酵母菌株、质粒和试剂 2
1.1.1酵母菌株 2
1.1.2质粒 2
1.1.3试剂 3
1.1.4主要仪器 3
1.2培养基 3
1.3培养条件 3
1.4 GFPAtg8的荧光标记及检测 3
1.4.1 SnaBⅠ酶切pRS303GFPAtg8质粒体系 3
1.4.2 荧光整合标记 3
1.4.3 荧光显微镜检测 4
1.5克隆SEC20基因 4
1.5.1质粒的提取 4
1.5.2重组质粒的大肠杆菌的鉴定 4
1.5.3重组质粒的酵母菌转化 5
1.5.4酵母菌生长检测 5
1.6 atg1?菌株构建 5
1.6.1酵母菌DNA的提取 5
1.6.2 PCR扩增 5
1.6.3 ATG1基因敲除 6
1.6.4 ATG1基因缺陷菌株鉴定 6
1.7 Western blot检测细胞自噬蛋白变化 6
2．结果与分析 7
2.1 atg1?菌株的构建 7
2.2 Western blot检测细胞自噬蛋白GFPAtg8降解情况 8
2.3荧光检测sec20ts中GFPAtg8的
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定位 9
2.4构建pRS423SEC20质粒并回补sec20ts突变体 10
2.4.1重组质粒pRS423SEC20 PCR验证 10
2.4.2 sec20ts中回补自身基因后的生长检测 10
2.5荧光检测转入pRS423SEC20的sec20ts中GFPAtg8的定位 11
3．讨论 12
致谢 12
参考文献： 12
酿酒酵母中SNARE蛋白Sec20影响细胞自噬的研究
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1.1酿酒酵母菌株、质粒和试剂 2
1.1.1酵母菌株 2
1.1.2质粒 2
1.1.3试剂 3
1.1.4主要仪器 3
1.2培养基 3
1.3培养条件 3
1.4 GFPAtg8的荧光标记及检测 3
1.4.1 SnaBⅠ酶切pRS303GFPAtg8质粒体系 3
1.4.2 荧光整合标记 3
1.4.3 荧光显微镜检测 4
1.5克隆SEC20基因 4
1.5.1质粒的提取 4
1.5.2重组质粒的大肠杆菌的鉴定 4
1.5.3重组质粒的酵母菌转化 5
1.5.4酵母菌生长检测 5
1.6 atg1?菌株构建 5
1.6.1酵母菌DNA的提取 5
1.6.2 PCR扩增 5
1.6.3 ATG1基因敲除 6
1.6.4 ATG1基因缺陷菌株鉴定 6
1.7 Western blot检测细胞自噬蛋白变化 6
2．结果与分析 7
2.1 atg1?菌株的构建 7
2.2 Western blot检测细胞自噬蛋白GFPAtg8降解情况 8
2.3荧光检测sec20ts中GFPAtg8的
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定位 9
2.4构建pRS423SEC20质粒并回补sec20ts突变体 10
2.4.1重组质粒pRS423SEC20 PCR验证 10
2.4.2 sec20ts中回补自身基因后的生长检测 10
2.5荧光检测转入pRS423SEC20的sec20ts中GFPAtg8的定位 11
3．讨论 12
致谢 12
参考文献： 12
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