灵芝胱硫醚β合酶的克隆和蛋白表达
目的为了获得灵芝胱硫醚β合酶（cystathionine beta-synthase,CBS），通过构建CBS原核表达载体，诱导表达于大肠杆菌（E.coli），从而纯化并获得目的蛋白。方法以灵芝cDNA为模板，以已发表的基因组序列为参照设计引物，通过PCR扩增CBS基因全序列，克隆入载体pMD19T,再装载到原核表达载体pET28a上构建重组载体pET28a-CBS，之后转入E.coli 中，利用IPTG（Isopropyl β-D-Thiogalactoside，异丙基硫代半乳糖苷）诱导表达目的蛋白，继而纯化。结果原核表达载体构建成功，但未能诱导表达出目的蛋白。结论在目前条件下加入IPTG后不能诱导表达出目的蛋白，需要继续改进探索以求目的蛋白的表达。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.1构建载体pMD19TCBS 2
1.2.2构建载体pET28aCBS 3
1.2.3 IPTG诱导 3
1.2.4 SDSPAGE验证、目的蛋白纯化 3
2 结果与分析4
2.1 克隆载体pMD19TCBS构建 4
2.2 原核表达载体pET28aCBS构建 5
2.3 IPTG诱导、SDSPAGE验证5
3讨论 7
3.1载体的选择 7
3.2菌株的选择 7
3.3感受态转化 7
3.4 E.coli BL21和Rosetta的表达差异 8
3.5原核表达载体pET28aCBS的构建 8
3.6 IPTG诱导目的蛋白表达8
3.7总结 8
致谢9
参考文献10
灵芝胱硫醚β合酶的克隆和蛋白表达
引言
胱硫醚β合酶（cystathionine betasynthase,CBS）是一种吡哆醛磷酸依赖性酶，以63 kDa的同源四聚体形式存在[1]，是近来发现的硫化氢合酶之一。 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
研究发现CBS是同型半胱氨酸（homocysteine,Hcy）转硫代谢途径中的一种起关键作用的酶，其催化过程是先将Hcy与丝氨酸(Ser)缩合成胱硫醚，继而胱硫醚在γ裂解酶的作用下形成半胱氨酸（cysteine,Cys）[2]，大约50%的Hcy 被CBS 和胱硫醚酶不可逆的转化为Cys[3]。因此CBS在人体内转硫代谢过程中起到至关重要的作用。因CBS基因突变等因素，其酶活性会下降并容易导致Hcy在体内积累过多，从而形成高同型半胱氨酸血症（Hyperhomocyseinemia,HHcy）[4,5],而HHcy是动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）的重要成因之一，与脑血管疾病、冠心病和血栓形成具有十分紧密的联系，对于人类健康有较大的威胁[6]。因而，CBS的生物学结构、性质和功能对于维持血浆中正常的Hcy水平至为关键。但由于天然状态的CBS 含量低，难以分离并获得大量的CBS天然产物，故本课题研究利用基因工程技术构建其原核表达载体pET28aCBS，继而在E.coli中诱导表达，以获得目的蛋白。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌株与载体 大肠杆菌(Escherichia coli)感受态DH5α、BL21、Rosetta由本实验室制备保存；pMD19T克隆载体、pET28a原核表达载体购自生物公司。
1．1．2 培养基 E.coli培养：LB培养基，感受态制备：SOBMg培养基，具体配方如表1所示：
表1 LB培养基与 SOBMg培养基配方
Tryptone 10g Peptone 20g
Yeast Extract 5g Yeast Extract 5g
NaCl 10g NaCl 0.5g
（固体培养基）琼脂粉 15g KCl 0.186g
MgCl2 0.95g
LB培养基 （1L） SOBMg培养基 （1L）
1．1．3 生化试剂 PCR:引物BDCBSF、BDCBSR（软件设计），ddH2O，Prime star Max，rTaq，dNTP，Buffer；TA克隆:T4 DNA Ligase，10×T4 Buffer；电泳:琼脂糖，缓冲液，核酸染料, Loading Buffer, DNA Marker；抗性试剂:Amp，Kan；质粒提取:SⅠ，SⅡ, SⅢ, 酚:氯仿:异丙醇（25:24:1）,无水乙醇,70%乙醇, RNA酶；胶回收:B2 Buffer, Elution Buffer, Wash Solution；酶切酶连:10×K Buffer, NdeⅠ, Hind Ⅲ, ddH2O, T4 DNA Ligase, 10×T4 Ligase Buffer；IPTG诱导:诱导剂IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）；SDSPAGE:SDS,AP,TEMED,TrisHCl（PH6.8, PH8.8）,ddH2O, 30%丙烯酰胺, Running Buffer,考马斯亮蓝,脱色液。
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.1构建载体pMD19TCBS 2
1.2.2构建载体pET28aCBS 3
1.2.3 IPTG诱导 3
1.2.4 SDSPAGE验证、目的蛋白纯化 3
2 结果与分析4
2.1 克隆载体pMD19TCBS构建 4
2.2 原核表达载体pET28aCBS构建 5
2.3 IPTG诱导、SDSPAGE验证5
3讨论 7
3.1载体的选择 7
3.2菌株的选择 7
3.3感受态转化 7
3.4 E.coli BL21和Rosetta的表达差异 8
3.5原核表达载体pET28aCBS的构建 8
3.6 IPTG诱导目的蛋白表达8
3.7总结 8
致谢9
参考文献10
灵芝胱硫醚β合酶的克隆和蛋白表达
引言
胱硫醚β合酶（cystathionine betasynthase,CBS）是一种吡哆醛磷酸依赖性酶，以63 kDa的同源四聚体形式存在[1]，是近来发现的硫化氢合酶之一。 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
研究发现CBS是同型半胱氨酸（homocysteine,Hcy）转硫代谢途径中的一种起关键作用的酶，其催化过程是先将Hcy与丝氨酸(Ser)缩合成胱硫醚，继而胱硫醚在γ裂解酶的作用下形成半胱氨酸（cysteine,Cys）[2]，大约50%的Hcy 被CBS 和胱硫醚酶不可逆的转化为Cys[3]。因此CBS在人体内转硫代谢过程中起到至关重要的作用。因CBS基因突变等因素，其酶活性会下降并容易导致Hcy在体内积累过多，从而形成高同型半胱氨酸血症（Hyperhomocyseinemia,HHcy）[4,5],而HHcy是动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）的重要成因之一，与脑血管疾病、冠心病和血栓形成具有十分紧密的联系，对于人类健康有较大的威胁[6]。因而，CBS的生物学结构、性质和功能对于维持血浆中正常的Hcy水平至为关键。但由于天然状态的CBS 含量低，难以分离并获得大量的CBS天然产物，故本课题研究利用基因工程技术构建其原核表达载体pET28aCBS，继而在E.coli中诱导表达，以获得目的蛋白。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌株与载体 大肠杆菌(Escherichia coli)感受态DH5α、BL21、Rosetta由本实验室制备保存；pMD19T克隆载体、pET28a原核表达载体购自生物公司。
1．1．2 培养基 E.coli培养：LB培养基，感受态制备：SOBMg培养基，具体配方如表1所示：
表1 LB培养基与 SOBMg培养基配方
Tryptone 10g Peptone 20g
Yeast Extract 5g Yeast Extract 5g
NaCl 10g NaCl 0.5g
（固体培养基）琼脂粉 15g KCl 0.186g
MgCl2 0.95g
LB培养基 （1L） SOBMg培养基 （1L）
1．1．3 生化试剂 PCR:引物BDCBSF、BDCBSR（软件设计），ddH2O，Prime star Max，rTaq，dNTP，Buffer；TA克隆:T4 DNA Ligase，10×T4 Buffer；电泳:琼脂糖，缓冲液，核酸染料, Loading Buffer, DNA Marker；抗性试剂:Amp，Kan；质粒提取:SⅠ，SⅡ, SⅢ, 酚:氯仿:异丙醇（25:24:1）,无水乙醇,70%乙醇, RNA酶；胶回收:B2 Buffer, Elution Buffer, Wash Solution；酶切酶连:10×K Buffer, NdeⅠ, Hind Ⅲ, ddH2O, T4 DNA Ligase, 10×T4 Ligase Buffer；IPTG诱导:诱导剂IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）；SDSPAGE:SDS,AP,TEMED,TrisHCl（PH6.8, PH8.8）,ddH2O, 30%丙烯酰胺, Running Buffer,考马斯亮蓝,脱色液。
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