铜胁迫对灵芝菌丝生长发育的影响
：NADPH氧化酶（NOX）是合成活性氧（ROS）的主要酶，本实验利用Cu2+胁迫野生型灵芝菌丝生长，检测其生长速度、灵芝三萜、ROS含量以及基因表达情况等指标，得到在Cu2+处理下，灵芝菌丝生理生化发生变化，菌丝生长变慢，灵芝三萜和ROS合成量增多。接下来采用NOX基因沉默菌株进一步研究Cu2+胁迫下NOX转化子中ROS含量的变化，检测生长速度、灵芝三萜含量的变化，分析ROS在铜胁迫灵芝菌丝中所起的作用，建立铜胁迫与ROS代谢以及生长发育之间的联系，为进一步揭示ROS的调控机制奠定了基础。
目录
摘要 2
关键词 2
ABSTRACT 2
KEY WORDS 2
引言 2
1 材料与方法 3
1．1 材料 3
1．1．1 供试菌株 3
1．1．2 CYM培养基的配制 3
1．1．3 主要试剂与溶液 3
1．1．4 主要仪器设备 3
1．2 方法 4
1．2．1 菌种平板活化 4
1．2．2 液体种子摇瓶培养 4
1．2．3 不同Cu2+浓度CYM固体培养基的配制 4
1．2．4 倒平板接种 4
1．2．5 二次摇瓶发酵培养 4
1．2．6 灵芝菌丝生长情况测定 4
1．2．7 胞内ROS荧光检测 4
1．2．8 灵芝三萜含量的测定 4
2 结果与分析 4
2．1 铜胁迫对野生型灵芝菌株（WT）ROS含量的影响 4
2．2 RTPCR检测合成ROS相关基因的表达 5
2．3 NOX转化子在0 mM、3 mM Cu2+浓度处理下的ROS含量变化 6
2．4 NOX转化子在0 mM、3 mM Cu2+浓度处理下的菌丝生长速度、灵芝三萜含量变化 7
3 讨论 9
3．1 铜胁迫对灵芝生长和次生代谢的影响 9
3．2 ROS对铜胁迫下灵芝生长代谢影响机制的探讨 9
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
致谢： 9
参考文献： 10
铜胁迫对灵芝菌丝生长发育的影响
生物技术 张蓓
引言
引言
灵芝（Ganoderma lucidum)别名赤芝、紫芝、木灵芝等，隶属于真菌门，担子菌亚门，层菌纲，非褶菌目，是灵芝菌科灵芝属的代表种，同时也是一种传统药食兼用真菌，在我国广泛分布，经过几十年的研究，目前有大量的人工栽培品种。国内外大量的研究结果证明，灵芝具有广泛的药理作用，且毒性极低，目前已经分离出三萜类、多糖类、氨基酸多肽类、核苷类、呋喃类、生物碱类、油脂以及微量元素等活性成分[13]。特别是灵芝三萜是其主要药用成分之一，具有降血脂、降血压、抗炎、抗衰老、提高人体免疫力等作用[46]。
正常情况下，氧在细胞中以氧化态的形式存在，性质不活泼，一旦在逆境胁迫下或有氧代谢中，氧化态的氧很容易得电子变成还原态的氧，比如超氧阴离子（O2）、过氧化氢（H2O2）、羟基自由基（OH）等物质，这类含氧化合物统称为活性氧（ROS, Reactive Oxygen Species）[7,8]。ROS作为细胞新陈代谢的产物对细胞自身具有毒害作用，会对生物体的生长发育和次级代谢产物的产生有一定影响，同时在生物体中作为一种信号分子参与各种生理生化反应[9]。之前已经有通过基因沉默法比较ROS含量的实验表明，NADPH氧化酶（NOX）催化氧分子生成活性氧，是ROS的主要酶，NADPH氧化酶基因对体内ROS的形成或积累起重要作用，若抑制该基因将导致体内ROS含量减少。同时检测NOX沉默菌株中灵芝三萜（GA）的生物合成的变化，以及检测GA生物合成的代谢中间过程发现，NADPH氧化酶基因可以通过调控ROS的含量参与调控灵芝三萜生物合成及菌丝分叉等表型。
铜是一种常见的金属元素，在植物中作为重要的微量元素参与植物碳素同化、氮素代谢和氧化还原反应，对植物体的生长发育有较大影响[10]。铜元素在植物中的影响作用之前已经有诸多研究，比如在外界重金属铜的胁迫下，能诱导产生很多ROS，有很强的化学反应活性，会对细胞内大分子造成伤害[11]。而抗氧化系统中的超氧化物岐化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）能够清除活性氧自由基，减轻ROS的损害。黄永杰等[12]用水培实验研究不同浓度铜离子对水花生生理特性的影响发现铜胁迫抑制植株正常生长，铜离子浓度低于5 mg/L时，植物细胞内的SOD、POD、CAT酶活性有所升高；铜离子浓度高于5 mg/L时，叶片叶绿素含量下降，生物量下降，植株生长缓慢，植物体内活性氧清除系统中的SOD、POD、CAT三种酶活性又逐渐下降。冀玉良等[13]研究铜胁迫对小麦幼苗的生长和保护系统的影响发现随着铜浓度的升高，根中和叶中SOD活性先上升后下降，POD活性持续上升，而CAT活性和脯氨酸（Pro）含量先下降后上升。杨昱等[14]研究大豆幼苗对铜的生理抗性机制也同样发现抗氧化系统在抵御过量的铜引起的胁迫过程中发挥了一定的作用。
但是在真菌特别是灵芝中，铜胁迫下研究真菌表型变化和分子机理的实验开展不多，而此前有研究表明食药用菌也会对重金属产生富集作用[15]，因此本课题将探讨ROS在铜对灵芝胁迫中起的作用。通过研究野生型灵芝菌株在不同浓度铜胁迫下ROS的产生情况，使用NOX转化子研究铜胁迫下ROS的产生途径。同时观察铜胁迫条件下对野生型以及NOX基因沉默菌株胞内灵芝三萜含量、菌丝生长速度的影响，试图建立铜胁迫与ROS代谢以及生长发育之间的联系。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株 野生型灵芝菌种（WT）、空载体灵芝菌株（CK）、NOX基因沉默灵芝菌株（NOXA3、NOXA5、NOXB3、NOXB7、NOXAB6、NOXAB10、NOXR4、NOXR7)，保存于大学生命科学学院应用真菌实验室。
1.1.2 CYM培养基 液体培养基：1 %麦芽糖，2 %葡萄糖，0.2 % Yeast Extract（酵母提取物），0.2 % peptone（蛋白胨），0.05 % MgSO47H2O，0.1 % K2HPO4 ，0.46 % K2HPO4。
固体培养基：将2 % Agar（琼脂）加入液体培养基中，115 ℃下灭菌30 min后使用。
1.1.3 主要试剂与溶液
目录
摘要 2
关键词 2
ABSTRACT 2
KEY WORDS 2
引言 2
1 材料与方法 3
1．1 材料 3
1．1．1 供试菌株 3
1．1．2 CYM培养基的配制 3
1．1．3 主要试剂与溶液 3
1．1．4 主要仪器设备 3
1．2 方法 4
1．2．1 菌种平板活化 4
1．2．2 液体种子摇瓶培养 4
1．2．3 不同Cu2+浓度CYM固体培养基的配制 4
1．2．4 倒平板接种 4
1．2．5 二次摇瓶发酵培养 4
1．2．6 灵芝菌丝生长情况测定 4
1．2．7 胞内ROS荧光检测 4
1．2．8 灵芝三萜含量的测定 4
2 结果与分析 4
2．1 铜胁迫对野生型灵芝菌株（WT）ROS含量的影响 4
2．2 RTPCR检测合成ROS相关基因的表达 5
2．3 NOX转化子在0 mM、3 mM Cu2+浓度处理下的ROS含量变化 6
2．4 NOX转化子在0 mM、3 mM Cu2+浓度处理下的菌丝生长速度、灵芝三萜含量变化 7
3 讨论 9
3．1 铜胁迫对灵芝生长和次生代谢的影响 9
3．2 ROS对铜胁迫下灵芝生长代谢影响机制的探讨 9
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
致谢： 9
参考文献： 10
铜胁迫对灵芝菌丝生长发育的影响
生物技术 张蓓
引言
引言
灵芝（Ganoderma lucidum)别名赤芝、紫芝、木灵芝等，隶属于真菌门，担子菌亚门，层菌纲，非褶菌目，是灵芝菌科灵芝属的代表种，同时也是一种传统药食兼用真菌，在我国广泛分布，经过几十年的研究，目前有大量的人工栽培品种。国内外大量的研究结果证明，灵芝具有广泛的药理作用，且毒性极低，目前已经分离出三萜类、多糖类、氨基酸多肽类、核苷类、呋喃类、生物碱类、油脂以及微量元素等活性成分[13]。特别是灵芝三萜是其主要药用成分之一，具有降血脂、降血压、抗炎、抗衰老、提高人体免疫力等作用[46]。
正常情况下，氧在细胞中以氧化态的形式存在，性质不活泼，一旦在逆境胁迫下或有氧代谢中，氧化态的氧很容易得电子变成还原态的氧，比如超氧阴离子（O2）、过氧化氢（H2O2）、羟基自由基（OH）等物质，这类含氧化合物统称为活性氧（ROS, Reactive Oxygen Species）[7,8]。ROS作为细胞新陈代谢的产物对细胞自身具有毒害作用，会对生物体的生长发育和次级代谢产物的产生有一定影响，同时在生物体中作为一种信号分子参与各种生理生化反应[9]。之前已经有通过基因沉默法比较ROS含量的实验表明，NADPH氧化酶（NOX）催化氧分子生成活性氧，是ROS的主要酶，NADPH氧化酶基因对体内ROS的形成或积累起重要作用，若抑制该基因将导致体内ROS含量减少。同时检测NOX沉默菌株中灵芝三萜（GA）的生物合成的变化，以及检测GA生物合成的代谢中间过程发现，NADPH氧化酶基因可以通过调控ROS的含量参与调控灵芝三萜生物合成及菌丝分叉等表型。
铜是一种常见的金属元素，在植物中作为重要的微量元素参与植物碳素同化、氮素代谢和氧化还原反应，对植物体的生长发育有较大影响[10]。铜元素在植物中的影响作用之前已经有诸多研究，比如在外界重金属铜的胁迫下，能诱导产生很多ROS，有很强的化学反应活性，会对细胞内大分子造成伤害[11]。而抗氧化系统中的超氧化物岐化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）能够清除活性氧自由基，减轻ROS的损害。黄永杰等[12]用水培实验研究不同浓度铜离子对水花生生理特性的影响发现铜胁迫抑制植株正常生长，铜离子浓度低于5 mg/L时，植物细胞内的SOD、POD、CAT酶活性有所升高；铜离子浓度高于5 mg/L时，叶片叶绿素含量下降，生物量下降，植株生长缓慢，植物体内活性氧清除系统中的SOD、POD、CAT三种酶活性又逐渐下降。冀玉良等[13]研究铜胁迫对小麦幼苗的生长和保护系统的影响发现随着铜浓度的升高，根中和叶中SOD活性先上升后下降，POD活性持续上升，而CAT活性和脯氨酸（Pro）含量先下降后上升。杨昱等[14]研究大豆幼苗对铜的生理抗性机制也同样发现抗氧化系统在抵御过量的铜引起的胁迫过程中发挥了一定的作用。
但是在真菌特别是灵芝中，铜胁迫下研究真菌表型变化和分子机理的实验开展不多，而此前有研究表明食药用菌也会对重金属产生富集作用[15]，因此本课题将探讨ROS在铜对灵芝胁迫中起的作用。通过研究野生型灵芝菌株在不同浓度铜胁迫下ROS的产生情况，使用NOX转化子研究铜胁迫下ROS的产生途径。同时观察铜胁迫条件下对野生型以及NOX基因沉默菌株胞内灵芝三萜含量、菌丝生长速度的影响，试图建立铜胁迫与ROS代谢以及生长发育之间的联系。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株 野生型灵芝菌种（WT）、空载体灵芝菌株（CK）、NOX基因沉默灵芝菌株（NOXA3、NOXA5、NOXB3、NOXB7、NOXAB6、NOXAB10、NOXR4、NOXR7)，保存于大学生命科学学院应用真菌实验室。
1.1.2 CYM培养基 液体培养基：1 %麦芽糖，2 %葡萄糖，0.2 % Yeast Extract（酵母提取物），0.2 % peptone（蛋白胨），0.05 % MgSO47H2O，0.1 % K2HPO4 ，0.46 % K2HPO4。
固体培养基：将2 % Agar（琼脂）加入液体培养基中，115 ℃下灭菌30 min后使用。
1.1.3 主要试剂与溶液
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