果胶甲酯酶基因ospme14突变对水稻生长及铜积累的影响
有研究表明果胶甲酯酶能够对植物生长进行调控，而且在植物抗逆方面起着重要作用。本实验对东津野生型水稻和OsPME14基因突变的水稻进行不同浓度的铜处理来探究果胶甲酯酶基因突变对水稻生长和铜积累的影响。同时克隆水稻的OsPME14基因并进行组织表达，以此来探究此基因突变对铜胁迫的响应。根据荧光定量PCR分析，铜处理浓度越高，OsPME14的表达水平也越高，而且在铜胁迫下，OsPME14在野生型中的表达水平显著高于突变体。铜处理结果还表明OsPME14基因突变对水稻地上部和地下部的生长都有明显抑制作用，同时会使水稻突变体细胞壁结合铜含量与野生型相比有所降低。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1 OsPME14基因的克隆2
1.2 筛选鉴定突变体5
1.3 OsPME14基因突变对铜胁迫的响应6
1.4 OsPME14基因突变对水稻生长和铜积累影响6
2结果与分析7
2.1基因的克隆7
2.2 OsPME14序列分析8
2.3突变体鉴定9
2.4 OsPME14基因突变对铜胁迫的响应9
2.5 OsPME14基因突变对水稻生长和铜积累影响9
3讨论 10
致谢11
参考文献11
果胶甲酯酶基因OsPME14突变对水稻生长及铜积累的影响
国家生命科学与技术人才培养基地 肖凌冉
引言
铜是植物生长的必须元素，但过量也会造成植物体的伤害。铜对植物的生理代谢过程的影响,以幼苗期表现最为突出,并最终导致植物体产量和品质的下降[1]。所以研究水稻应对重金属胁迫的机理是非常有意义的。
果胶是构成植物细胞初生壁和胞间层的主要组分，它在维持组织的完整性和机械强度方面起着重要的作用。果胶同时还关系着细胞的粘附、胞间连接及植物发育。果胶由半乳糖醛酸聚糖,鼠李半乳醛酸聚糖组成,而且在不同植物及不同组织中果胶组成成分各不相同[2]。果胶甲酯酶（Pectin Methylesterases，PME） *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
是一类普遍存在于微生物与高等植物中的酶，它与细胞壁的结构变化密切相关。果胶甲酯酶能够通过对细胞壁的成分进行修饰来调控植物的多种发育过程，如形成层细胞分化、花粉萌发、花粉管生长等。 植物的果胶甲酯酶在细胞壁果胶的新陈代谢方面起作用[35]，因此参与到了植物的重要的营养及生殖发育的过程中，如细胞壁的扩展和加强、细胞的粘附和布局，叶子生长、果实成熟及植物抗逆等。尤其是关于PME在植物抗逆方面的作用近年来受到了国内外的广泛关注。Pan等人[6]实验结果表明，在悬空气培养条件下，果胶甲基酯酶的活性在根尖1 mm处活性最高。选择铝耐性不同的大麦品种，对其PME活性进行检测后，结果发现，在不同浓度的铝处理条件下，两个大麦品种根尖的PME活性出现了不同的变化，说明铝害胁迫会对植物根尖的PME活性产生一定的影响。而拟南芥的基因芯片数据库显示，高达75%的PME序列的表达是为了应对生物性和非生物性胁迫。比如说一些PME的转录受到严寒、创伤、乙烯[7]，寡聚半乳糖醛酸[8]和吸食韧皮部汁液昆虫[9]的调控。在反义或过表达植物系中也可以观察到PME活动的变化。同时研究表明细胞壁中果胶的甲酯化程度与植物对致病菌和非生物胁迫的敏感性变化相关[1012]。而果胶甲酯酶作为可以调控果胶甲酯化程度的酶与植物对逆境的敏感性变化也是密切相关的。
正因为已有众多研究表明了果胶甲酯酶基因的表达在植物抗逆过程中起了一定的作用。所以我们希望通过克隆和表达果胶甲酯酶基因OsPME14来进一步研究水稻应对重金属胁迫的机理。本实验通过克隆果胶甲酯酶基因OsPME14 ，并进行组织表达，来探究果胶甲酯酶基因对铜胁迫的响应。同时鉴定筛选OsPME14水稻突变体植株，分析铜处理对水稻突变体和野生型植株生长及铜积累的影响，以明确OsPME14在植物耐铜性中的生理功能，为更好得明确OsPME14基因在水稻抗铜胁迫的生理机能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 OsPME14基因的克隆
1.1.1 RNA的提取
1、将超低温冻存的水稻根样品迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，期间不断加入液氮，直至研磨成粉末状。将研磨成粉末状的样品0.1g加入到含有450μl Buffer RL（使用前已加入50×DTT Solution）的1.5ml灭菌tube中，用移液器反复吹打直到裂解液中无明显沉淀。
2、将裂解液12,000rpm，4℃离心5分钟。
3、将上清液小心吸取到新的1.5ml灭菌tube中。
4、加入样品裂解步骤中上清液1/2体积的无水乙醇，使用移液枪将溶液混合均匀。
5、立即将混合液全部转入到RNA 离心管（含2ml 收集管）中。
6、12,000rpm，离心1分钟，弃滤液。将RNA 离心管放回到2ml 收集管中。
将500μl Buffer RWA加入至RNA Spin Column中，12,000rpm离心30秒，弃滤液。
将600μl Buffer RWB加入至RNA Spin Column中，12,000rpm离心30秒，弃滤液。
确认Buffer RWB中已经加入了指定体积的100%乙醇。
沿RNA Spin Column管壁四周加入Buffer RWB，这样有助于完全冲洗粘附于管壁上的盐分。
DNase I 消化
① DNase I 反应液的配制：取5μl 10×DNase I Buffer，4μl Recombinant DNase I，41μl RNase free dH2O 到新的1.5ml RNase Free Tube 中，混合均匀。
② 向RNA Spin Column膜中央加入50μl DNase I 反应液，室温静置15分钟。
③ 向RNA Spin Column膜中央加入350μl Buffer RWB，12,000rpm离心30秒，弃滤液。
10、重复操作步骤5。
11、将RNA Spin Column重新安置于2ml Collection Tube上，12,000rpm离心2分钟。
12、将RNA Spin Column安置于1.5ml RNase Free Collection Tube上，在RNA Spin Column 膜中央加入100μl的RNase free dH2O，室温静置5分钟。
13、12,000rpm离心2分钟洗脱RNA。
1.1.2 反转录
1、在离心管中准备一下混合液
成分
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1 OsPME14基因的克隆2
1.2 筛选鉴定突变体5
1.3 OsPME14基因突变对铜胁迫的响应6
1.4 OsPME14基因突变对水稻生长和铜积累影响6
2结果与分析7
2.1基因的克隆7
2.2 OsPME14序列分析8
2.3突变体鉴定9
2.4 OsPME14基因突变对铜胁迫的响应9
2.5 OsPME14基因突变对水稻生长和铜积累影响9
3讨论 10
致谢11
参考文献11
果胶甲酯酶基因OsPME14突变对水稻生长及铜积累的影响
国家生命科学与技术人才培养基地 肖凌冉
引言
铜是植物生长的必须元素，但过量也会造成植物体的伤害。铜对植物的生理代谢过程的影响,以幼苗期表现最为突出,并最终导致植物体产量和品质的下降[1]。所以研究水稻应对重金属胁迫的机理是非常有意义的。
果胶是构成植物细胞初生壁和胞间层的主要组分，它在维持组织的完整性和机械强度方面起着重要的作用。果胶同时还关系着细胞的粘附、胞间连接及植物发育。果胶由半乳糖醛酸聚糖,鼠李半乳醛酸聚糖组成,而且在不同植物及不同组织中果胶组成成分各不相同[2]。果胶甲酯酶（Pectin Methylesterases，PME） *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
是一类普遍存在于微生物与高等植物中的酶，它与细胞壁的结构变化密切相关。果胶甲酯酶能够通过对细胞壁的成分进行修饰来调控植物的多种发育过程，如形成层细胞分化、花粉萌发、花粉管生长等。 植物的果胶甲酯酶在细胞壁果胶的新陈代谢方面起作用[35]，因此参与到了植物的重要的营养及生殖发育的过程中，如细胞壁的扩展和加强、细胞的粘附和布局，叶子生长、果实成熟及植物抗逆等。尤其是关于PME在植物抗逆方面的作用近年来受到了国内外的广泛关注。Pan等人[6]实验结果表明，在悬空气培养条件下，果胶甲基酯酶的活性在根尖1 mm处活性最高。选择铝耐性不同的大麦品种，对其PME活性进行检测后，结果发现，在不同浓度的铝处理条件下，两个大麦品种根尖的PME活性出现了不同的变化，说明铝害胁迫会对植物根尖的PME活性产生一定的影响。而拟南芥的基因芯片数据库显示，高达75%的PME序列的表达是为了应对生物性和非生物性胁迫。比如说一些PME的转录受到严寒、创伤、乙烯[7]，寡聚半乳糖醛酸[8]和吸食韧皮部汁液昆虫[9]的调控。在反义或过表达植物系中也可以观察到PME活动的变化。同时研究表明细胞壁中果胶的甲酯化程度与植物对致病菌和非生物胁迫的敏感性变化相关[1012]。而果胶甲酯酶作为可以调控果胶甲酯化程度的酶与植物对逆境的敏感性变化也是密切相关的。
正因为已有众多研究表明了果胶甲酯酶基因的表达在植物抗逆过程中起了一定的作用。所以我们希望通过克隆和表达果胶甲酯酶基因OsPME14来进一步研究水稻应对重金属胁迫的机理。本实验通过克隆果胶甲酯酶基因OsPME14 ，并进行组织表达，来探究果胶甲酯酶基因对铜胁迫的响应。同时鉴定筛选OsPME14水稻突变体植株，分析铜处理对水稻突变体和野生型植株生长及铜积累的影响，以明确OsPME14在植物耐铜性中的生理功能，为更好得明确OsPME14基因在水稻抗铜胁迫的生理机能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 OsPME14基因的克隆
1.1.1 RNA的提取
1、将超低温冻存的水稻根样品迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，期间不断加入液氮，直至研磨成粉末状。将研磨成粉末状的样品0.1g加入到含有450μl Buffer RL（使用前已加入50×DTT Solution）的1.5ml灭菌tube中，用移液器反复吹打直到裂解液中无明显沉淀。
2、将裂解液12,000rpm，4℃离心5分钟。
3、将上清液小心吸取到新的1.5ml灭菌tube中。
4、加入样品裂解步骤中上清液1/2体积的无水乙醇，使用移液枪将溶液混合均匀。
5、立即将混合液全部转入到RNA 离心管（含2ml 收集管）中。
6、12,000rpm，离心1分钟，弃滤液。将RNA 离心管放回到2ml 收集管中。
将500μl Buffer RWA加入至RNA Spin Column中，12,000rpm离心30秒，弃滤液。
将600μl Buffer RWB加入至RNA Spin Column中，12,000rpm离心30秒，弃滤液。
确认Buffer RWB中已经加入了指定体积的100%乙醇。
沿RNA Spin Column管壁四周加入Buffer RWB，这样有助于完全冲洗粘附于管壁上的盐分。
DNase I 消化
① DNase I 反应液的配制：取5μl 10×DNase I Buffer，4μl Recombinant DNase I，41μl RNase free dH2O 到新的1.5ml RNase Free Tube 中，混合均匀。
② 向RNA Spin Column膜中央加入50μl DNase I 反应液，室温静置15分钟。
③ 向RNA Spin Column膜中央加入350μl Buffer RWB，12,000rpm离心30秒，弃滤液。
10、重复操作步骤5。
11、将RNA Spin Column重新安置于2ml Collection Tube上，12,000rpm离心2分钟。
12、将RNA Spin Column安置于1.5ml RNase Free Collection Tube上，在RNA Spin Column 膜中央加入100μl的RNase free dH2O，室温静置5分钟。
13、12,000rpm离心2分钟洗脱RNA。
1.1.2 反转录
1、在离心管中准备一下混合液
成分
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