灵芝血红素单加氧酶基因全长的克隆及基因功能研究
灵芝血红素单加氧酶基因全长的克隆及基因功能研究[20200614171420]
摘要：作物根系多环芳烃(PAHs)与氮素吸收的相互作用的研究对于强化农田PAHs污染环境的植物修复效果具有重要意义。本文以菲为PAHs代表，采用活体测定法研究了小麦、大豆和莴苣根系硝酸还原酶活性（NR）对硝态氮和铵态氮与菲共存下的响应。结果表明：无论菲处理与否，两种形态的氮素均能明显提高作物根系NR活性，硝态氮的促进效果更好。同一氮素水平，菲或无菲处理的作物根系NR活性因作物品种不同差异较大。在硝态氮的存在下，菲处理作物根系NR的米氏常数均小于相应的无菲处理，而亲和力则反之，说明菲处理对此三种植物的NR活性具有促进作用。因此，菲增强了根系NR与NO3-的亲和力是菲与不同形态氮共存促进作物根系NR活性的重要原因。
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关键字:多环芳烃；菲；氮素形态；硝酸还原酶；作物根系
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 供试材料 2
1．2 试验方法 2
1.2.1 幼苗的培养 2
1.2.2 水培试验 2
1.2.3 硝酸还原酶活性测定 2
1.2.4 试验处理设置 2
1.3数据统计分析 3
2 结果与分析 3
2.1菲与硝态氮共存条件下小麦、大豆和莴苣根系NR活性 3
2.2菲与铵态氮共存条件下小麦、大豆和莴苣根系NR活性 4
2.3 菲与铵态和硝态氮共存条件下小麦、大豆、莴苣根系NR活性 5
3 讨论 5
致谢 6
参考文献 7
作物根系硝酸还原酶对多环芳烃与氮素吸收互作的响应
引言
多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是由石油、煤等化石燃料及木材、烟草等有机物料在不完全燃烧过程中产生的一类中性或非极性有机污染物。因其具有较强的致癌、致畸、致突变性和生物难降解性而倍受关注[1-2]，且被许多国家列入优先污染物的黑名单或灰名单中[3]，环境中90%以上的PAHs赋存于土壤中[4]，这必然会危及作物的安全，并通过食物链传递进而威胁人类的健康[5-7]。因此，植物根系对多环芳烃的吸收作用及其机制的研究受到研究者的高度重视。
研究表明，需载体协助和耗能的主动过程参与了小麦根系对多环芳烃——菲（PHE）的吸收[8]，且主动过程是以H+/PHE共运方式进入植物根系细胞内，介质低pH可促进 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
根系PHE吸收[9]。氮肥是农业生产中广泛使用的肥料，对植物根际pH、OH-及有机酸阴离子的平衡具有较大的影响[10]。植物根系吸收NH4+将引起根系细胞内阳离子富集，为了维持电荷平衡，根系细胞会主动分泌H+，导致根际pH下降[11]；而根系NO3-吸收会造成根际pH上升[12]。由此推测，植物根系PAHs吸收和氮素吸收有可能通过根际pH的变化而发生相互作用。前期结果显示，铵态氮能促进作物根系对菲的吸收，而硝态氮对菲的吸收则存在抑制作用。然而此现象的原因至今尚未明了，国内外此类报道也较为少见，而此类研究对于农产品的安全生产和PAHs污染环境的修复意义重大。
为探讨上述现象的酶学机制，本文以小麦、大豆和莴苣为供试作物，研究作物苗期菲与NH4+和NO3-共同作用对根系硝酸还原酶（氮代谢过程中一个重要的调节酶和限速酶）活性的影响，拟在酶学水平阐明根系吸收PAHs与N素养分的相互作用机制，为采取可行的农艺施肥措施阻控PAHs对食物链的污染和促进植物修复PAHs污染土壤及水体的效果提供科学依据。
1 材料与方法
1．1 供试材料
供试小麦(Triticum aestivum L.)品种为‘南农9918’;大豆(Glycine max L.)品种为‘皖豆15’；莴苣(Latuca sativa L.)品种为‘特耐寒二白皮’。这3种作物种子购自江苏省农业科学院种子站，均是江苏地区的主要栽培品种。
1．2 试验方法
1.2.1 幼苗的培养 取一定量种子用去离子水浮选去除瘪粒，然后选取比较均一的种子用3% H2O2消毒5 min。水洗净后的种子置于底部铺有石英砂的搪瓷托盘中，在28 ℃恒温培养箱中进行催芽。种子出芽后转移至25 ℃人工气候箱内，去离子水培养7 d，每天换水1次，备用。
1.2.2 水培试验 选择长势比较一致的植株幼苗移入容积为600 mL且外裹黑色防水纸的烧杯中（小麦每杯20株,大豆每杯8株,莴苣每杯30株），先后在500 mL 1/2浓度和全浓度的Hoagland营养液中各培养3 d,再换成超纯水饥饿培养1 d。小麦、大豆、莴苣植株株高分别约为15、20和10 cm。
1.2.3 硝酸还原酶活性测定 采用活体法测定根系硝酸还原酶（NR）活性，用改进的磺胺法比色[13]。作物根部用纯水冲洗并用吸水纸吸干表面水分。取幼嫩的根1.0 g，切成1 cm小段，放入25 mL的小烧杯中，加入反应液（0.05 molL-1 Tris-HCl缓冲液，pH为7.5）10 mL，然后分别加入不同浓度的氮素和菲（以无菲的处理为对照组），置于真空干燥器中，抽真空1 min，反复几次，至材料充分软化沉入烧杯底部为止，最后一次通入氮气，如无氮气，可让其保持真空状态(阻止亚硝酸还原反应)。然后在32 ℃下避光培养6 h后取出，加入0.1 molL-1 HCl 2 mL终止反应。吸2 mL上清液，加3 mL水，再加3 mL 1％的磺胺和2 mL 0.02％的α-萘胺，摇匀，显色30 min后在540 nm波长处比色。同时配置亚硝酸钠标准溶液。以每小时每克根系鲜样产生1 μg NO2-为一个酶活性单位，表示为μgg-1h-1。
1.2.4 试验处理设置 氮素和菲处理如下：①对照组,固定反应液体系中菲浓度为0μmolL-1（用P *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
0表示）。氮素浓度分别设置10个水平，具体为0、0.5、5和15 mmolL-1 NaNO3，分别用N1、N2、N3、N4表示；0.5、5和15 mmolL-1 NH4Cl，分别用N5、N6、N7表示；铵态氮与硝态氮 (NH4+-NO3-) 3:1（3.75 mmolL-1 NH4Cl与1.25 mmolL-1 NaNO3），NH4+-NO3-比1:1（2.25 mmolL-1 NH4Cl和2.25 mmolL-1 NaNO3），NH4+-NO3-1:3（1.25 mmolL-1 NH4Cl与3.75 mmolL-1 NaNO3）分别用N8、N9、N10表示。②试验组,固定反应液体系中菲浓度为5.61 μmolL-1（用P1表示）。氮素浓度设置同对照组。最后每种作物共有20个氮和菲的处理组合，分别记为：N1P0、N2P0、N3P0、N4P0、N5P0、N6P0、N7P0、N8P0、N9P0、N10P0、N1P1、N2P1、N3P1、N4P1、N5P1、N6P1、N7P1、N8P1、N9P1、N10P1。每个处理组合重复3次。
菲处理用菲的甲醇溶液加入，且对照组与试验组反应液中含有等量的甲醇，浓度约为2.74×10-3 mmolL-1。
1.3数据统计分析
采用Excel 2003和Origin 8.0软件进行数据处理、作图和差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1菲与硝态氮共存条件下小麦、大豆和莴苣根系NR活性
从图1可见，在外加硝态氮条件下，菲和无菲处理6 h，随着硝态氮处理浓度的增加,小麦、大豆、莴苣的根系NR活性都呈现升高的趋势。小麦、大豆、莴苣N4P1处理组合根系NR活性分别为36.05、15.30 和10.65 μgg-1h-1；小麦、大豆、莴苣N1P1处理组合根系NR活性则分别为5.31、3.05和1.89 μgg-1h-1。小麦、大豆、莴苣N4P0处理组合根系NR活性分别为35.27、12.75和9.70 μgg-1h-1；小麦、大豆、莴苣N1P0处理组合根系NR活性则分别为4.09、2.06和1.62 μgg-1h-1。这表明硝态氮可增进小麦、大豆、莴苣根系NR的活性。
摘要：作物根系多环芳烃(PAHs)与氮素吸收的相互作用的研究对于强化农田PAHs污染环境的植物修复效果具有重要意义。本文以菲为PAHs代表，采用活体测定法研究了小麦、大豆和莴苣根系硝酸还原酶活性（NR）对硝态氮和铵态氮与菲共存下的响应。结果表明：无论菲处理与否，两种形态的氮素均能明显提高作物根系NR活性，硝态氮的促进效果更好。同一氮素水平，菲或无菲处理的作物根系NR活性因作物品种不同差异较大。在硝态氮的存在下，菲处理作物根系NR的米氏常数均小于相应的无菲处理，而亲和力则反之，说明菲处理对此三种植物的NR活性具有促进作用。因此，菲增强了根系NR与NO3-的亲和力是菲与不同形态氮共存促进作物根系NR活性的重要原因。
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关键字:多环芳烃；菲；氮素形态；硝酸还原酶；作物根系
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 供试材料 2
1．2 试验方法 2
1.2.1 幼苗的培养 2
1.2.2 水培试验 2
1.2.3 硝酸还原酶活性测定 2
1.2.4 试验处理设置 2
1.3数据统计分析 3
2 结果与分析 3
2.1菲与硝态氮共存条件下小麦、大豆和莴苣根系NR活性 3
2.2菲与铵态氮共存条件下小麦、大豆和莴苣根系NR活性 4
2.3 菲与铵态和硝态氮共存条件下小麦、大豆、莴苣根系NR活性 5
3 讨论 5
致谢 6
参考文献 7
作物根系硝酸还原酶对多环芳烃与氮素吸收互作的响应
引言
多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是由石油、煤等化石燃料及木材、烟草等有机物料在不完全燃烧过程中产生的一类中性或非极性有机污染物。因其具有较强的致癌、致畸、致突变性和生物难降解性而倍受关注[1-2]，且被许多国家列入优先污染物的黑名单或灰名单中[3]，环境中90%以上的PAHs赋存于土壤中[4]，这必然会危及作物的安全，并通过食物链传递进而威胁人类的健康[5-7]。因此，植物根系对多环芳烃的吸收作用及其机制的研究受到研究者的高度重视。
研究表明，需载体协助和耗能的主动过程参与了小麦根系对多环芳烃——菲（PHE）的吸收[8]，且主动过程是以H+/PHE共运方式进入植物根系细胞内，介质低pH可促进 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
根系PHE吸收[9]。氮肥是农业生产中广泛使用的肥料，对植物根际pH、OH-及有机酸阴离子的平衡具有较大的影响[10]。植物根系吸收NH4+将引起根系细胞内阳离子富集，为了维持电荷平衡，根系细胞会主动分泌H+，导致根际pH下降[11]；而根系NO3-吸收会造成根际pH上升[12]。由此推测，植物根系PAHs吸收和氮素吸收有可能通过根际pH的变化而发生相互作用。前期结果显示，铵态氮能促进作物根系对菲的吸收，而硝态氮对菲的吸收则存在抑制作用。然而此现象的原因至今尚未明了，国内外此类报道也较为少见，而此类研究对于农产品的安全生产和PAHs污染环境的修复意义重大。
为探讨上述现象的酶学机制，本文以小麦、大豆和莴苣为供试作物，研究作物苗期菲与NH4+和NO3-共同作用对根系硝酸还原酶（氮代谢过程中一个重要的调节酶和限速酶）活性的影响，拟在酶学水平阐明根系吸收PAHs与N素养分的相互作用机制，为采取可行的农艺施肥措施阻控PAHs对食物链的污染和促进植物修复PAHs污染土壤及水体的效果提供科学依据。
1 材料与方法
1．1 供试材料
供试小麦(Triticum aestivum L.)品种为‘南农9918’;大豆(Glycine max L.)品种为‘皖豆15’；莴苣(Latuca sativa L.)品种为‘特耐寒二白皮’。这3种作物种子购自江苏省农业科学院种子站，均是江苏地区的主要栽培品种。
1．2 试验方法
1.2.1 幼苗的培养 取一定量种子用去离子水浮选去除瘪粒，然后选取比较均一的种子用3% H2O2消毒5 min。水洗净后的种子置于底部铺有石英砂的搪瓷托盘中，在28 ℃恒温培养箱中进行催芽。种子出芽后转移至25 ℃人工气候箱内，去离子水培养7 d，每天换水1次，备用。
1.2.2 水培试验 选择长势比较一致的植株幼苗移入容积为600 mL且外裹黑色防水纸的烧杯中（小麦每杯20株,大豆每杯8株,莴苣每杯30株），先后在500 mL 1/2浓度和全浓度的Hoagland营养液中各培养3 d,再换成超纯水饥饿培养1 d。小麦、大豆、莴苣植株株高分别约为15、20和10 cm。
1.2.3 硝酸还原酶活性测定 采用活体法测定根系硝酸还原酶（NR）活性，用改进的磺胺法比色[13]。作物根部用纯水冲洗并用吸水纸吸干表面水分。取幼嫩的根1.0 g，切成1 cm小段，放入25 mL的小烧杯中，加入反应液（0.05 molL-1 Tris-HCl缓冲液，pH为7.5）10 mL，然后分别加入不同浓度的氮素和菲（以无菲的处理为对照组），置于真空干燥器中，抽真空1 min，反复几次，至材料充分软化沉入烧杯底部为止，最后一次通入氮气，如无氮气，可让其保持真空状态(阻止亚硝酸还原反应)。然后在32 ℃下避光培养6 h后取出，加入0.1 molL-1 HCl 2 mL终止反应。吸2 mL上清液，加3 mL水，再加3 mL 1％的磺胺和2 mL 0.02％的α-萘胺，摇匀，显色30 min后在540 nm波长处比色。同时配置亚硝酸钠标准溶液。以每小时每克根系鲜样产生1 μg NO2-为一个酶活性单位，表示为μgg-1h-1。
1.2.4 试验处理设置 氮素和菲处理如下：①对照组,固定反应液体系中菲浓度为0μmolL-1（用P *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
0表示）。氮素浓度分别设置10个水平，具体为0、0.5、5和15 mmolL-1 NaNO3，分别用N1、N2、N3、N4表示；0.5、5和15 mmolL-1 NH4Cl，分别用N5、N6、N7表示；铵态氮与硝态氮 (NH4+-NO3-) 3:1（3.75 mmolL-1 NH4Cl与1.25 mmolL-1 NaNO3），NH4+-NO3-比1:1（2.25 mmolL-1 NH4Cl和2.25 mmolL-1 NaNO3），NH4+-NO3-1:3（1.25 mmolL-1 NH4Cl与3.75 mmolL-1 NaNO3）分别用N8、N9、N10表示。②试验组,固定反应液体系中菲浓度为5.61 μmolL-1（用P1表示）。氮素浓度设置同对照组。最后每种作物共有20个氮和菲的处理组合，分别记为：N1P0、N2P0、N3P0、N4P0、N5P0、N6P0、N7P0、N8P0、N9P0、N10P0、N1P1、N2P1、N3P1、N4P1、N5P1、N6P1、N7P1、N8P1、N9P1、N10P1。每个处理组合重复3次。
菲处理用菲的甲醇溶液加入，且对照组与试验组反应液中含有等量的甲醇，浓度约为2.74×10-3 mmolL-1。
1.3数据统计分析
采用Excel 2003和Origin 8.0软件进行数据处理、作图和差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1菲与硝态氮共存条件下小麦、大豆和莴苣根系NR活性
从图1可见，在外加硝态氮条件下，菲和无菲处理6 h，随着硝态氮处理浓度的增加,小麦、大豆、莴苣的根系NR活性都呈现升高的趋势。小麦、大豆、莴苣N4P1处理组合根系NR活性分别为36.05、15.30 和10.65 μgg-1h-1；小麦、大豆、莴苣N1P1处理组合根系NR活性则分别为5.31、3.05和1.89 μgg-1h-1。小麦、大豆、莴苣N4P0处理组合根系NR活性分别为35.27、12.75和9.70 μgg-1h-1；小麦、大豆、莴苣N1P0处理组合根系NR活性则分别为4.09、2.06和1.62 μgg-1h-1。这表明硝态氮可增进小麦、大豆、莴苣根系NR的活性。
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