多菌灵降解菌株分离和生物学特性研究
采集长期施用多菌灵的土壤，从中分离出一株能够有效降解多菌灵的菌株D3。结合菌株形态特征及16S rDNA系统发育分析，将菌株D3鉴定为分枝杆菌属（Mycobacterium sp.）并对菌株D3进行生长和降解特性研究。菌株D3能够利用多菌灵做为唯一碳氮源生长，且在72 h内将50 mg?L-1的多菌灵几乎全部降解。菌株D3生长的最适pH为6.0-7.0，最适NaCl浓度为0-5g?L-1,最佳碳源为葡萄糖，最佳有机氮源为蛋白胨，无机氮源为KNO3，具有多粘菌素B和克林霉素抗性。使用响应面法对菌株降解多菌灵的条件进行优化，模拟出最佳降解条件温度35.07℃，pH值7.17，接种量14.33%。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引 言 2
1. 材料与方法 2
1.1 培养基与试剂 2
1.2 菌株与质粒 3
1.3 多菌灵降解菌株的分离、筛选及鉴定 3
1.3.1 多菌灵降解菌的分离 3
1.3.2 多菌灵降解菌的筛选 3
1.3.3 菌株基因组总DNA的提取 3
1.3.4 降解菌株16S rDNA基因序列的鉴定 4
1.3.3.1 菌株16S rDNA基因序列扩增 4
1.3.3.2 对PCR产物进行TA克隆 4
1.3.3.3 质粒DNA的小量提取 4
1.3.3.4 降解菌株16S rDNA基因序列测定 5
1.3.3.5 降解菌株系统发育地位的确定 5
1.4 降解菌株生长量的测定 5
1.5 菌株D3对多菌灵降解的研究 5
1.5.1 测量方法 5
1.5.2 多菌灵标准曲线的制作 6
1.6 菌株的培养和接种 6
2. 结果与分析 6
2.1多菌灵降解菌株的分离与筛选 6
2.2 降解菌株D3的分类学鉴定 7
2.3 环境条件对降解菌株D3生长的影响 8
2.3.1 温度对菌株D3的生长的影响 8
2. *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
3.2 pH值对菌株D3生长的影响 8
2.3.3 通气量对降解菌株D3生长的影响 9
2.3.4 NaCl浓度对降解菌株生长的影响 9
2.3.5 降解菌株的碳源利用情况 10
2.3.6 降解菌株的氮源利用情况 10
2.3.7 降解菌株对抗生素耐受情况 11
2.4 多菌灵降解菌株的降解特性研究 12
2.4.1 温度对菌株D3降解多菌灵的影响 12
2.4.2 pH对菌株D3降解多菌灵的影响 12
2.4.3 NaCl对菌株D3降解多菌灵的影响 13
2.4.4 通气量对菌株D3降解多菌灵的影响 13
2.4.5 接种量对菌株D3降解多菌灵的影响 13
2.4.6 重金属对菌株D3降解多菌灵的影响 14
2.5 响应面法对菌株D3降解多菌灵条件的优化 14
2.6 最优条件下菌株D3的生长和降解性能 17
3. 讨论 18
致 谢 20
参考文献 21
多菌灵降解菌分离和生物学特性研究
生物技术131 禹幸
引言
引言
多菌灵是一种高效低毒广谱杀菌剂[1]，常用来预防和治理植物作物的真菌病害（如半知菌、多子囊菌等[2])。是很多苯并咪唑类杀菌剂的代谢产物和活性中心，在土壤、水体和农作物中都能检测到多菌灵的残留。许多苯并咪唑类杀菌剂的主要水解产物和起作用的活性成分都为多菌灵，如苯菌灵、氰菌灵和甲基托布津。多菌灵在预防和治虫害方面运用广泛。多菌灵的分子式为C9H9N3O2，其相对分子质量为191.2，化学结构式见图1。
图1 多菌灵化学结构式
多菌灵在土壤中的化学性质稳定，半衰期长，长时间使用易造成土壤污染。在自然条件下，生物降解是多菌灵的主要降解途径。多菌灵可在水果蔬菜等作物中残留和累积，对动物肝、肾和生殖系统[34]具有潜在的破坏作用，还易导致免疫功能下降和染色体畸变，从而影响后代繁衍[58]。光降解是目前降解多菌灵的常用方法之一。Ricard Panades等[9]的研究结果显示，在紫外光条件下，变量溶液中溶解氧气浓度和pH都会影响多菌灵的光降解能力。徐宝才等[10]的研究结果显示，分别在高压汞灯和太阳光的条件下，多菌灵的降解不同，同时降解能力还受到溶剂的影响。周立敏等[11]同样研究了高压汞灯和太阳光对多菌灵的光降解能力，发现在高压汞灯能有效地进行多菌灵的光降解，但在自然光下，不同溶剂中，多菌灵稳定。
微生物由于其数量大、种类多、基因资源丰富等特性，微生物修复是污染治理，有害物质处理研究中的热点。Helweg A等[12]的研究结果表明苯并咪唑类农药如何被自然界的微生物降解。Fuchs等[13]进行了首次纯菌种分离的研究，发现了假单胞菌属（Pseudomonas sp.）能够降解2氨基苯并咪唑。王呈玉等[14]分离到一株Raoultella sp. MBC，该菌72 h内对500 mg?L1多菌灵的降解率为100%。Lei等[15]分离到一株能够降解多菌灵的Microbacterium sp. djl6F。
本课题拟通过纯化筛选得到能有效降解农药多菌灵的菌株，并研究其生物学特性和降解特性，可为通过生物修复多菌灵污染提供理论依据，同时为我国的环保事业做出贡献。分离出降解菌株之后优化其培养条件，为其更好地修复多菌灵污染提供理论支持。
材料与方法
1.1 培养基与试剂
多菌灵原药（含量99%），来自于江苏新沂农药厂；2氨基苯并咪唑（纯度98%）和2羟基苯并咪唑(纯度98%)购自百灵威科技有限公司。
基础盐培养基MSM(gL1)：NaCl 0.50 g，(NH4)2SO4 1.00 g，K2HPO4 1.50 g，KH2PO4 0.50 g，MgSO47H2O 0.20 g，去离子水1000 mL，pH7.0。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引 言 2
1. 材料与方法 2
1.1 培养基与试剂 2
1.2 菌株与质粒 3
1.3 多菌灵降解菌株的分离、筛选及鉴定 3
1.3.1 多菌灵降解菌的分离 3
1.3.2 多菌灵降解菌的筛选 3
1.3.3 菌株基因组总DNA的提取 3
1.3.4 降解菌株16S rDNA基因序列的鉴定 4
1.3.3.1 菌株16S rDNA基因序列扩增 4
1.3.3.2 对PCR产物进行TA克隆 4
1.3.3.3 质粒DNA的小量提取 4
1.3.3.4 降解菌株16S rDNA基因序列测定 5
1.3.3.5 降解菌株系统发育地位的确定 5
1.4 降解菌株生长量的测定 5
1.5 菌株D3对多菌灵降解的研究 5
1.5.1 测量方法 5
1.5.2 多菌灵标准曲线的制作 6
1.6 菌株的培养和接种 6
2. 结果与分析 6
2.1多菌灵降解菌株的分离与筛选 6
2.2 降解菌株D3的分类学鉴定 7
2.3 环境条件对降解菌株D3生长的影响 8
2.3.1 温度对菌株D3的生长的影响 8
2. *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
3.2 pH值对菌株D3生长的影响 8
2.3.3 通气量对降解菌株D3生长的影响 9
2.3.4 NaCl浓度对降解菌株生长的影响 9
2.3.5 降解菌株的碳源利用情况 10
2.3.6 降解菌株的氮源利用情况 10
2.3.7 降解菌株对抗生素耐受情况 11
2.4 多菌灵降解菌株的降解特性研究 12
2.4.1 温度对菌株D3降解多菌灵的影响 12
2.4.2 pH对菌株D3降解多菌灵的影响 12
2.4.3 NaCl对菌株D3降解多菌灵的影响 13
2.4.4 通气量对菌株D3降解多菌灵的影响 13
2.4.5 接种量对菌株D3降解多菌灵的影响 13
2.4.6 重金属对菌株D3降解多菌灵的影响 14
2.5 响应面法对菌株D3降解多菌灵条件的优化 14
2.6 最优条件下菌株D3的生长和降解性能 17
3. 讨论 18
致 谢 20
参考文献 21
多菌灵降解菌分离和生物学特性研究
生物技术131 禹幸
引言
引言
多菌灵是一种高效低毒广谱杀菌剂[1]，常用来预防和治理植物作物的真菌病害（如半知菌、多子囊菌等[2])。是很多苯并咪唑类杀菌剂的代谢产物和活性中心，在土壤、水体和农作物中都能检测到多菌灵的残留。许多苯并咪唑类杀菌剂的主要水解产物和起作用的活性成分都为多菌灵，如苯菌灵、氰菌灵和甲基托布津。多菌灵在预防和治虫害方面运用广泛。多菌灵的分子式为C9H9N3O2，其相对分子质量为191.2，化学结构式见图1。
图1 多菌灵化学结构式
多菌灵在土壤中的化学性质稳定，半衰期长，长时间使用易造成土壤污染。在自然条件下，生物降解是多菌灵的主要降解途径。多菌灵可在水果蔬菜等作物中残留和累积，对动物肝、肾和生殖系统[34]具有潜在的破坏作用，还易导致免疫功能下降和染色体畸变，从而影响后代繁衍[58]。光降解是目前降解多菌灵的常用方法之一。Ricard Panades等[9]的研究结果显示，在紫外光条件下，变量溶液中溶解氧气浓度和pH都会影响多菌灵的光降解能力。徐宝才等[10]的研究结果显示，分别在高压汞灯和太阳光的条件下，多菌灵的降解不同，同时降解能力还受到溶剂的影响。周立敏等[11]同样研究了高压汞灯和太阳光对多菌灵的光降解能力，发现在高压汞灯能有效地进行多菌灵的光降解，但在自然光下，不同溶剂中，多菌灵稳定。
微生物由于其数量大、种类多、基因资源丰富等特性，微生物修复是污染治理，有害物质处理研究中的热点。Helweg A等[12]的研究结果表明苯并咪唑类农药如何被自然界的微生物降解。Fuchs等[13]进行了首次纯菌种分离的研究，发现了假单胞菌属（Pseudomonas sp.）能够降解2氨基苯并咪唑。王呈玉等[14]分离到一株Raoultella sp. MBC，该菌72 h内对500 mg?L1多菌灵的降解率为100%。Lei等[15]分离到一株能够降解多菌灵的Microbacterium sp. djl6F。
本课题拟通过纯化筛选得到能有效降解农药多菌灵的菌株，并研究其生物学特性和降解特性，可为通过生物修复多菌灵污染提供理论依据，同时为我国的环保事业做出贡献。分离出降解菌株之后优化其培养条件，为其更好地修复多菌灵污染提供理论支持。
材料与方法
1.1 培养基与试剂
多菌灵原药（含量99%），来自于江苏新沂农药厂；2氨基苯并咪唑（纯度98%）和2羟基苯并咪唑(纯度98%)购自百灵威科技有限公司。
基础盐培养基MSM(gL1)：NaCl 0.50 g，(NH4)2SO4 1.00 g，K2HPO4 1.50 g，KH2PO4 0.50 g，MgSO47H2O 0.20 g，去离子水1000 mL，pH7.0。
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/swgc/smkx/116.html
