铜污染土壤修复植物厌氧发酵接种物的初步筛选和驯化研究
铜污染土壤修复植物厌氧发酵接种物的初步筛选和驯化研究[20200614171354]
摘要:对重金属污染土壤修复植物进行厌氧发酵可以实现资源利用和污染治理的双赢。本试验期望在污水处理厂污泥，农科院污泥和河道污泥三种接种物中筛选出最适的接种物。根据接种后修复植物的产气、产甲烷情况以及物料的理化环境指标来考察接种物的活性和驯化情况，优化接种物驯化条件。结果表明：污水处理厂污泥相对于其他两种污泥是较易被驯化。污水处理厂污泥驯化时间需要7d左右，农科院污泥为12d，河道污泥为14d。其中，污泥配比农∶污为1∶3和农∶污为1∶1对于月见草厌氧发酵具有促进作用。在污泥驯化的过程中添加100ppm的Cu2+，对月见草厌氧发酵有促进作用。
关键字：修复植物；厌氧发酵；接种物；驯化
Screening and Domestication of copper-cotaminatiated repair plant
Student majoring in biotechnology Sunhan
Tutor chenyahua
Abstract: Heavy metal contamination of soil remediation plant can achieve a win-win for anaerobic fermentation of resource use and pollution control. The trial is expected to find out the most suitable inoculums of these three material: sludge in sewage treatment plants, sludge in biogas projects and river sludge. Physico-chemical environment ,the amount of gas after inoculation, as well as the product of the materials are based to examine the situation of the inoculum and domesticated optimize inoculum acclimation.With three kinds of sludge as the research object, compared the effects of anaerobic digestion biogas production.The inoculum was optimized by using different proportions of sludge. Results showed that the sludge from Sewage Treatment Plant was easier to be domesticated than others. In addition, different proportions of sludge had promoting effect on anaerobic digestion. Add 100 mg kg–1 Cu during sludge domesticated would promote anaerobic digestion.
引言: 近几十年来，全球经济蓬勃发展，农业生产集约化、城市化、工业化导致全球土壤的重金属污染情况逐年加剧（Cheng，2003）。土壤重金属污染已经成为目前危害最大的环境污染问题之一。重金属对土壤的污染是一个长期的过程，它不仅破坏了土壤环境，同时降低农作物的产量和质量，并且最终能够通过食物链危及人类的身体健康（Diels 等，2002；Muchuweti 等，2006）。
土壤重金属污染的植物修复技术是利用某些植物对重金属所具有富集或超富集作用，来转移或容纳土壤中的重金属以减少其对土壤危害性目的的环境友好型方法。植物修复是一个长期的过程，因此会产生出大量的富含重金属的植物材料，如何将这些修复植物材料合理处置，资源化利用，避免二次污染，也就成了植物修复研究中迫切需要解决的关键科学问题之一。
厌氧发酵是一种有效的重金属污染土壤修复植物治理和资源回收利用技术。对铜污染土壤的修复植物进行沼气发酵，产生的沼气可作为清洁能源利用；沼气发酵后的沼渣、沼液经安全评估后作为有机肥应用于盐碱土改良。通过这条产后处置途径可以实现修复材料的最大资源化利用。该方法绿色环保，还能解决能源和有机肥料问题，使植物修复从产前到产后形成一个完整的产业链。
修复植物的厌氧发酵存在的问题是在发酵运行之初,需加入优质足量的厌氧菌作为接种物来保证植物材料的发酵的稳定运行。一方面由于目前普遍使用的传统厌氧菌极少有适应底物为修复植物的菌种;另一方面,国内外对于接种物的研发都还处于试验阶段,尚无大规模应用（陈佳一，2004）。在有机物厌氧生物处理过程中，接种微生物对于厌氧发酵产气阶段的运行起决定作用(Lopes Leite and Prasad，2003)，目前在研究厌氧发酵时，国内外研究者大多采用经过驯化的厌氧活性污泥作为接种物， 污泥主要取自污水处理厂厌氧发酵池的活性污泥、化粪池的厌氧污泥和池塘污泥等(Sosnow等，2003；V Nallathambi, 2004)，也有研究者采用中温条件下以牛粪等材料作为接种物。不同的接种物对厌氧发酵的反应启动速率影响很大。所以本实验欲找到合适的接种物及驯化条件，为修复植物的厌氧发酵提供基础与条件。
1 材料与方法
1.1 试验装置
采用实验室自制厌氧发酵装置。1L广口瓶作为厌氧发酵的反应器，另采用1L广口瓶作为集气装置，瓶中装满水，反应瓶和与集气瓶之间以橡胶管道连接，取气部位于集气瓶和反应器之间，如图1所示。发酵产生的气体的量通过排水集气法测定。
图1. 厌氧发酵反应流程图.
1. 恒温水浴锅; 2. 反应器; 3. 气体采样口; 4. 集气瓶; 5. 量筒
1.2不同接种物厌氧发酵产沼气效果的比较
1.2.1试验材料
三种厌氧发酵接种物分别为污水处理厂污泥（采自南京城东污水处理厂），农科院污泥（宜兴坤兴养猪场沼气工程沼渣），河道污泥（采自南京市中山陵风景区）。基本理化性状见表1
发酵接种物营养液的配制：按照100g葡萄糖添加9.03g NH4HCO3、1.4g KH2PO4、0.3g CaCl2·2H2O、0.45g MgSO4·7H2O（配成1L）。
表1 厌氧发酵底物的基本性状 (%)
Table 1 The basic properties of anaerobic digestion raw materials (%)
处理 TS/% VS/%
污水处理厂污泥 23.9 8.1
沼气工程沼渣 16.5 7.3
河道污泥 18.1 2.3
1.2.2实验方法
试验以1L广口瓶为反应器，在反应器中加入等质量的三种污泥（400g），每日添加5mL的营养液进行活化。试验组与对照组各设2个重复，发酵周期直至三组污泥的甲烷含量均达到50%截止，分别记录每种污泥甲烷含量达到50%所需的天数。
1.3污泥的初步驯化
1.3.1 试验材料
月见草，采自江苏南京汤山铜矿附近农田，风干，备用。接种物污水处理厂污泥，采自南京城东污水处理厂，接种物总固体含量（TS）为11.36%，挥发性固体（VS）为5.20%。发酵底物的基本理化性状见表2
表2 厌氧发酵底物的基本性状 (%)
Table 3.2 The basic properties of anaerobic digestion raw materials (%)
底物原料 TOC/g·kg-1 K-N/g·kg-1 C/N Cu/mg·kg-1
月见草 427.7 13.0 33.0 24.6
1.3.2 试验方法
试验选择100mg/kg硫酸铜作为外源的添加铜形态来模拟植物体内的铜。试验所用的发酵底物月见草均添加等量的硫酸铜，发酵接种物则分别添加100mg/kg硫酸铜、500mg/kg硫酸铜和1000mg/kg硫酸铜驯化，待产生的气体甲烷含量达到50%时，加入发酵底物进行发酵试验。试验以1L广口瓶为反应器，有效容积为500mL，37℃水浴培养。试验材料以尿素为氮源调节C/N至25:1，加水调节各处理干物质（TS）含量为20%。试验处理见表3.3，同时设纯接种物为空白对照，试验组与对照组各设2个重复，发酵周期30天。
表3 试验方案
Table 3 Experiment design
处理 月见草+100mg/kg硫酸铜
污泥 A
污泥+100mg/kg硫酸铜 B
污泥+500mg/kg硫酸铜 C
污泥+1000mg/kg硫酸铜 D
1.4铜污染土壤修复植物材料厌氧发酵接种物的驯化
1.4.1 试验材料
月见草，采自江苏南京汤山铜矿附近农田，风干，备用。接种物采用南京城东污水处理厂污泥和农科院污泥（宜兴坤兴养猪场沼气工程沼渣）。发酵底物和接种物的基本理化性状见表4
表4 厌氧发酵底物的基本性状 (%)
Table 3.4 The basic properties of anaerobic digestion raw materials (%)
底物原料 TOC/g·kg-1 K-N/g·kg-1 C/N Cu/mg·kg-1
月见草 427.7 13.0 33.0 24.6
处理 TS/% VS/%
污水处理厂污泥 23.9 8.1
沼气工程沼渣 16.5 7.3
1.4.2 试验方法
将污水处理厂污泥和农科院污泥以1∶3，1∶1，3∶1的比例进行混合后，进行活化，直至产生的气体甲烷含量达到50%为止，然后作为发酵接种物与月见草混合进行厌氧发酵。试验以1L广口瓶为反应器，有效容积为500mL，37℃水浴培养。试验材料以尿素为氮源调节C/N至25:1，加水调节各处理干物质（TS）含量为20%。试验处理见表3.5，同时设纯接种物为空白对照，试验组与对照组各设3个重复，发酵周期26天。
表5 试验方案
Table 3.5 Experiment design
处理 月见草质量（g）
农∶污（1∶3） 40
农∶污（1∶1） 40
农∶污（3∶1） 40
月见草 40
1.5数据测定
1.5.1沼气及甲烷的测定
沼气每天定时使用排水法收集，并采用量筒测量。甲烷的测定采用南京仁华GC-9890A气相色谱仪，TDX-02B色谱柱（￠4mm×0.5m），以H2为载气，载气流量30 mL/min，TCD检测器进行分析，柱温100℃，检测器温度120℃，进样量为0.5 mL，采用外标法测定样品中的甲烷含量。
1.5.2总固体含量(TS)、挥发性固体含量(VS)测定
测定原理：植物经低温碳化和高温灼烧后氧化，使碳水化合物等有机物分解并以二氧化碳和水的形式挥发而消失，其烧失量即为有机物总量，剩下不可燃烧的残渣为灰分元素的氧化物，称量后即可计算挥发性固体含量(VS)的质量分数。
操作步骤：将瓷坩埚置于马弗炉中525℃±10℃温度下灼烧30min，取出后稍冷，移入干燥器内平衡30min，取出称量记录重量。再放入马弗炉中525℃±10℃灼烧10min后取出，冷却称量，直至两次质量之差小于0.5mg即为恒量M0。将待测样放入已知质量的25mL瓷坩埚中，在105℃±2℃的电热恒温箱中烘烤8h，取出后放入干燥器内平衡30min，称量即为M1。在电炉上（坩埚盖斜放）缓慢碳化，逐步提高电炉温度，直到不再出现黑烟，并且样品呈现出灰白色为止。将坩埚移入马弗炉（盖斜放）于525℃±10℃灼烧2h，取出后稍加冷却，移入干燥器中平衡30min，称量即为M2。
由下式计算得出总固体含量(TS)含量。
总固体(TS)量%(烘干基)=(M1－M2)/(M1－M0)*100
挥发性固体(VS)总量%(烘干基)=(M2－M0)/(M1－M0)*100
式中：M0——坩埚质量，g；
M1——灼烧前瓷坩埚及内容物质量，g；
M2——灼烧后瓷坩埚及内容物质量，g。
1.5.3碳氮比（C/N）测定
有机碳含量测定：采用重铬酸钾氧化-外加热法(Clesceri 等，2005)；测定原理：利用浓硫酸和重铬酸钾迅速混合时所产生的热量来氧化有机质，剩余的重铬酸钾用硫酸亚铁来滴定，通过所消耗的重铬酸钾的量来计算有机碳的含量。由于产生的热量温度较低，对有机质氧化程度较低，只有77%，因此将测得的有机质需要乘以校正系数1.33。
操作步骤：准确称取0.2000g样品于500mL三角瓶中，然后准确加入1N K2Cr2O7溶液10mL，混合均匀后加入浓硫酸20mL，混匀，放置于常温下30min，加水稀释至250mL，加入3-4滴邻啡罗啉，用0.5N FeSO4溶液滴定，溶液颜色由绿色到暗绿色直至成砖红色。用同样的方法做空白测定（不加样品）。
由下式计算出有机碳的含量。
式中：V1—滴定空白样所用FeSO4溶液毫升数；
V2—滴定样品所用FeSO4溶液毫升数；
c—所用FeSO4溶液的当量浓度；
0.003—为1个毫克当量碳的克数；
1.33—氧化矫正系数；
1.724—有机碳转化为有机质的平均换算系数；
m—样品干重(g)。
全氮含量测定：采用H2SO4-H2O2消煮，蒸馏定氮法(Clesceri 等，2005)。操作原理：植物样品在浓硫酸溶液中，经过脱水碳化、氧化等一系列作用，而氧化剂H2O2在热浓硫酸溶液中分解出的新生态氧化【H2O2→H2O2+[O]】具有强烈的氧化作用，分解H2SO4没有破坏的有机物和碳，使有机氮、磷等转化为无机铵盐和磷酸盐等，因此可以在同一消煮液中分别测得N、P、K等元素。
操作步骤：称取磨细烘干的植物样品（过0.25-0.5mm筛）0.1000-0.2000g，置于消煮管中，先用水湿润样品，然后加浓H2SO4 5mL，轻轻摇匀（最好放置过夜），在消煮炉上先通过低温缓缓加热，待浓硫酸分解冒白烟后逐渐升高温度。当溶液全部呈现棕黑色时，从消煮炉上取下消煮管，稍加冷却后，逐滴加入300g/L H2O2 10滴，并不断摇动消煮管（应直接滴入瓶底溶液中，若滴在瓶壁上，H2O2会很快分解，失去氧化效果），以便反应充分进行。再加热至微沸10-20min，稍冷后再加入H2O2 5-10滴。如此反复2-3次，直至消煮液呈无色或清亮色后，再加热5-10min，以除尽过剩的双氧水（否则会影响测定）。冷却后，将消煮液用超纯水定容至100mL，取过滤液供全氮含量的测定。消煮时应同时做空白试验以校正试剂误差。取过滤后的消煮液10mL于洗净干燥后的消煮管中， 将消煮管放入定氮仪中蒸馏。在250mL锥形瓶中，加入 20 g/L H3BO3指示剂混合液20mL，放在冷凝管末端收集蒸馏液。用0.01 mol/L（1/2 H2SO4）标准溶液滴定馏出液由蓝绿色至刚变为紫红色。记录所用酸标准溶液的体积（mL）。空白测定所用酸标准溶液的体积，一般不得超过0.4mL。
由下式计算出全氮的含量。
式中：V—滴定试液时所用酸标准溶液的体积（mL）；
V0—滴定空白时所用酸标准溶液的体积（mL）；
c—0.01 mol/L（1/2 H2SO4）标准溶液的浓度；
14.0—氮原子的摩尔质量（g/mol）;
10-3—将mL换算成L；
m—烘干土样的质量（g）；
n—消煮液定容体积/所取蒸馏液体积。
2 结果与分析
2.1三种污泥产气特性的比较
图2为三种污泥活化过程的厌氧发酵每日产气量曲线图。不同的污泥活化过程日产气量的产气规律不同。污水处理厂污泥在第3d开始，日产气量就维持在300mL左右，农科院污泥从第2d开始，日产气量始终保持在200mL左右，河道污泥日产气量前期始终维持在一个较低的水平，直至12d日产气量达到200mL后，才逐渐趋于稳定。
图3为三种污泥活化过程的厌氧发酵累积产气量的示意图。活化过程共持续了17d，它们的累积产气量大小依次为污水处理厂污泥（4809mL）＞农科院污泥（3232mL）＞河道污泥（2639mL）。
图4是三种污泥活化过程的厌氧发酵甲烷含量的曲线图。污水处理厂污泥在第5d甲烷含量即达到了50%，农科院污泥甲烷含量达到50%的时间为第12d，而河道污泥直至15d甲烷含量才达到了50%。
综上可得，污水处理厂污泥相对于沼气工程沼渣和河道污泥是一种好的易于驯化厌氧发酵接种物。
图2 不同污泥厌氧发酵的累积产气量
Figure 3.1 Cumulative biogas production of different sludges during anaerobic digestion.
图3 不同污泥厌氧发酵的累积产气量
Figure 3.2 Cumulative biogas production of different sludges during anaerobic digestion.
图4 不同污泥厌氧发酵的甲烷含量
Figure 3.3 CH4 content of different sludges during 50 days’ anaerobic fermentation.
2.2 不同浓度铜离子对厌氧发酵的影响
四组处理厌氧发酵46 d的日产气量如图5所示，A、B两组的日产气量趋势类似，C、D两组的日产气量曲线类似。4个处理均在厌氧发酵初期（4d左右）出现一个日产气量高峰，其中，A、B两组的日产气量峰值接近，C、D两组的日产气量峰值接近。这就说明虽然在进行厌氧发酵前，四组处理的接种物均已活化，但是活化时加入不同浓度的铜确实对厌氧发酵产生了影响，铜浓度越高，对发酵的影响越大。
厌氧发酵46 d各处理的累积产气量如下图所示，可以看出，累积产气量的大小依次为B（8344mL）＞A（7336mL）＞C（5364mL）＞D（5245mL）。根据第二章的研究结果，100 mg/kg 铜对厌氧发酵有促进作用，所以在接种物中加入100 mg/kg 铜进行活化后，同样对厌氧发酵有促进作用。
A:污泥 B: 污泥+100mg/kg硫酸铜 C: 污泥+500mg/kg硫酸铜 D: 污泥+1000mg/kg硫酸铜
图5 不同处理植物厌氧发酵的日产气量
Figure5 Daily biogas production of different treatments during anaerobic digestion.
A:污泥 B: 污泥+100mg/kg硫酸铜 C: 污泥+500mg/kg硫酸铜 D: 污泥+1000mg/kg硫酸铜
图6 不同处理植物厌氧发酵的累积产气量
Figure 6 Cumulative biogas production of different treatments during anaerobic digestion.
2.3不同比例的混合污泥发酵特点
图7为农科院污泥和污水处理厂污泥不同配比厌氧发酵每日产气量示意图。不同处理日产气量呈现出相似的变化规律，但是，可以看出启动时间最短的是农∶污（1∶3）。各处理均在第6d左右出现日产气量峰值，随后缓慢下降，趋于稳定。
图8为农科院污泥和污水处理厂污泥不同配比厌氧发酵累积产气量曲线图。经过26d的厌氧发酵过程，四组处理的累积产气量分别为（农︰污 1:3）（9282mL）﹥（农︰污 1:1）（7832mL）﹥（农︰污 3:1）（6963mL）﹥月见草（6825mL）。根据统计学分析结果，可以发现累积产气（农：污 1:3）和（农︰污 1:1）差异显著，（农︰污 1:1）与（农︰污 3:1）和月见草差异显著，（农︰污 3:1）和月见草处理之间差异不显著。说明农︰污 1:3和农︰污 1:3对于月见草污泥发酵具有促进作用，农︰污 3:1对厌氧发酵无影响。
图7 不同处理植物厌氧发酵的日产气量
Figure 7 Daily biogas production of different treatments during anaerobic digestion.
图8 不同处理植物厌氧发酵的累积产气量
Figure 8 Cumulative biogas production of different treatments during anaerobic digestion.
图9 不同处理厌氧发酵的甲烷含量
Figure 9 CH4 content of different treatments during 50 days’ anaerobic fermentation.
表6 不同处理累积产气量的差异显著性分析
Table 6. Effects of the cumulative gas production of different treatments after 30 days of anaerobic digestion
处理 累积产气量
农∶污（1∶3） 9310±248 a
农∶污（1∶1） 7820±156 b
农∶污（3∶1） 6933±153 c
月见草 6833±115 b
注：不同处理间不同小写字母表示有显著差异（P＜0.05）
总结与讨论
从上述试验中可以发现污水处理厂污泥相对于其他两种污泥是较易被驯化。污水处理厂污泥驯化时间需要7d左右，农科院污泥为12d，河道污泥为14d。其中，污泥配比农∶污为1∶3和农∶污为1∶1对于月见草厌氧发酵具有促进作用。在污泥驯化的过程中添加100ppm的Cu2+，对月见草厌氧发酵有促进作用。
但是试验中依然存在问题需要进一步改进与研究。如试验未使用原位的重金属污染土壤修复植物作为发酵底物，对试验的结果说服力不强。还有试验仅仅在实验室进行了小规模的试验，未进行规模更大的中试，对于今后的应用缺乏必要的数据。在今后的实验中也可以扩大筛选污泥的种类，不同污泥之间配比的不同组合亦可相应得增加，以期能得到更加合理有效的驯化方案。
致谢
参考文献
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摘要 2
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引言: 2
1 材料与方法 3
1.1 试验装置 3
1.2不同接种物厌氧发酵产沼气效果的比较 3
1.2.1试验材料 3
1.2.2实验方法 4
1.3污泥的初步驯化 4
1.3.1 试验材料 4
1.3.2 试验方法 4
1.4铜污染土壤修复植物材料厌氧发酵接种物的驯化 5
1.4.1 试验材料 5
1.4.2 试验方法 5
1.5数据测定 5
1.5.1沼气及甲烷的测定 5
1.5.2总固体含量(TS)、挥发性固体含量(VS)测定 5
1.5.3碳氮比（C/N）测定 6
2 结果与分析 7
2.1三种污泥产气特性的比较 7
2.2 不同浓度铜离子对厌氧发酵的影响 9
2.3不同比例的混合污泥发酵特点 10
总结与讨论 12
致谢 13
参考文献 13
铜污染土壤修复植物厌氧发酵接种物的初步筛选和驯化研究
引言
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关键字：修复植物；厌氧发酵；接种物；驯化
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Abstract: Heavy metal contamination of soil remediation plant can achieve a win-win for anaerobic fermentation of resource use and pollution control. The trial is expected to find out the most suitable inoculums of these three material: sludge in sewage treatment plants, sludge in biogas projects and river sludge. Physico-chemical environment ,the amount of gas after inoculation, as well as the product of the materials are based to examine the situation of the inoculum and domesticated optimize inoculum acclimation.With three kinds of sludge as the research object, compared the effects of anaerobic digestion biogas production.The inoculum was optimized by using different proportions of sludge. Results showed that the sludge from Sewage Treatment Plant was easier to be domesticated than others. In addition, different proportions of sludge had promoting effect on anaerobic digestion. Add 100 mg kg–1 Cu during sludge domesticated would promote anaerobic digestion.
引言: 近几十年来，全球经济蓬勃发展，农业生产集约化、城市化、工业化导致全球土壤的重金属污染情况逐年加剧（Cheng，2003）。土壤重金属污染已经成为目前危害最大的环境污染问题之一。重金属对土壤的污染是一个长期的过程，它不仅破坏了土壤环境，同时降低农作物的产量和质量，并且最终能够通过食物链危及人类的身体健康（Diels 等，2002；Muchuweti 等，2006）。
土壤重金属污染的植物修复技术是利用某些植物对重金属所具有富集或超富集作用，来转移或容纳土壤中的重金属以减少其对土壤危害性目的的环境友好型方法。植物修复是一个长期的过程，因此会产生出大量的富含重金属的植物材料，如何将这些修复植物材料合理处置，资源化利用，避免二次污染，也就成了植物修复研究中迫切需要解决的关键科学问题之一。
厌氧发酵是一种有效的重金属污染土壤修复植物治理和资源回收利用技术。对铜污染土壤的修复植物进行沼气发酵，产生的沼气可作为清洁能源利用；沼气发酵后的沼渣、沼液经安全评估后作为有机肥应用于盐碱土改良。通过这条产后处置途径可以实现修复材料的最大资源化利用。该方法绿色环保，还能解决能源和有机肥料问题，使植物修复从产前到产后形成一个完整的产业链。
修复植物的厌氧发酵存在的问题是在发酵运行之初,需加入优质足量的厌氧菌作为接种物来保证植物材料的发酵的稳定运行。一方面由于目前普遍使用的传统厌氧菌极少有适应底物为修复植物的菌种;另一方面,国内外对于接种物的研发都还处于试验阶段,尚无大规模应用（陈佳一，2004）。在有机物厌氧生物处理过程中，接种微生物对于厌氧发酵产气阶段的运行起决定作用(Lopes Leite and Prasad，2003)，目前在研究厌氧发酵时，国内外研究者大多采用经过驯化的厌氧活性污泥作为接种物， 污泥主要取自污水处理厂厌氧发酵池的活性污泥、化粪池的厌氧污泥和池塘污泥等(Sosnow等，2003；V Nallathambi, 2004)，也有研究者采用中温条件下以牛粪等材料作为接种物。不同的接种物对厌氧发酵的反应启动速率影响很大。所以本实验欲找到合适的接种物及驯化条件，为修复植物的厌氧发酵提供基础与条件。
1 材料与方法
1.1 试验装置
采用实验室自制厌氧发酵装置。1L广口瓶作为厌氧发酵的反应器，另采用1L广口瓶作为集气装置，瓶中装满水，反应瓶和与集气瓶之间以橡胶管道连接，取气部位于集气瓶和反应器之间，如图1所示。发酵产生的气体的量通过排水集气法测定。
图1. 厌氧发酵反应流程图.
1. 恒温水浴锅; 2. 反应器; 3. 气体采样口; 4. 集气瓶; 5. 量筒
1.2不同接种物厌氧发酵产沼气效果的比较
1.2.1试验材料
三种厌氧发酵接种物分别为污水处理厂污泥（采自南京城东污水处理厂），农科院污泥（宜兴坤兴养猪场沼气工程沼渣），河道污泥（采自南京市中山陵风景区）。基本理化性状见表1
发酵接种物营养液的配制：按照100g葡萄糖添加9.03g NH4HCO3、1.4g KH2PO4、0.3g CaCl2·2H2O、0.45g MgSO4·7H2O（配成1L）。
表1 厌氧发酵底物的基本性状 (%)
Table 1 The basic properties of anaerobic digestion raw materials (%)
处理 TS/% VS/%
污水处理厂污泥 23.9 8.1
沼气工程沼渣 16.5 7.3
河道污泥 18.1 2.3
1.2.2实验方法
试验以1L广口瓶为反应器，在反应器中加入等质量的三种污泥（400g），每日添加5mL的营养液进行活化。试验组与对照组各设2个重复，发酵周期直至三组污泥的甲烷含量均达到50%截止，分别记录每种污泥甲烷含量达到50%所需的天数。
1.3污泥的初步驯化
1.3.1 试验材料
月见草，采自江苏南京汤山铜矿附近农田，风干，备用。接种物污水处理厂污泥，采自南京城东污水处理厂，接种物总固体含量（TS）为11.36%，挥发性固体（VS）为5.20%。发酵底物的基本理化性状见表2
表2 厌氧发酵底物的基本性状 (%)
Table 3.2 The basic properties of anaerobic digestion raw materials (%)
底物原料 TOC/g·kg-1 K-N/g·kg-1 C/N Cu/mg·kg-1
月见草 427.7 13.0 33.0 24.6
1.3.2 试验方法
试验选择100mg/kg硫酸铜作为外源的添加铜形态来模拟植物体内的铜。试验所用的发酵底物月见草均添加等量的硫酸铜，发酵接种物则分别添加100mg/kg硫酸铜、500mg/kg硫酸铜和1000mg/kg硫酸铜驯化，待产生的气体甲烷含量达到50%时，加入发酵底物进行发酵试验。试验以1L广口瓶为反应器，有效容积为500mL，37℃水浴培养。试验材料以尿素为氮源调节C/N至25:1，加水调节各处理干物质（TS）含量为20%。试验处理见表3.3，同时设纯接种物为空白对照，试验组与对照组各设2个重复，发酵周期30天。
表3 试验方案
Table 3 Experiment design
处理 月见草+100mg/kg硫酸铜
污泥 A
污泥+100mg/kg硫酸铜 B
污泥+500mg/kg硫酸铜 C
污泥+1000mg/kg硫酸铜 D
1.4铜污染土壤修复植物材料厌氧发酵接种物的驯化
1.4.1 试验材料
月见草，采自江苏南京汤山铜矿附近农田，风干，备用。接种物采用南京城东污水处理厂污泥和农科院污泥（宜兴坤兴养猪场沼气工程沼渣）。发酵底物和接种物的基本理化性状见表4
表4 厌氧发酵底物的基本性状 (%)
Table 3.4 The basic properties of anaerobic digestion raw materials (%)
底物原料 TOC/g·kg-1 K-N/g·kg-1 C/N Cu/mg·kg-1
月见草 427.7 13.0 33.0 24.6
处理 TS/% VS/%
污水处理厂污泥 23.9 8.1
沼气工程沼渣 16.5 7.3
1.4.2 试验方法
将污水处理厂污泥和农科院污泥以1∶3，1∶1，3∶1的比例进行混合后，进行活化，直至产生的气体甲烷含量达到50%为止，然后作为发酵接种物与月见草混合进行厌氧发酵。试验以1L广口瓶为反应器，有效容积为500mL，37℃水浴培养。试验材料以尿素为氮源调节C/N至25:1，加水调节各处理干物质（TS）含量为20%。试验处理见表3.5，同时设纯接种物为空白对照，试验组与对照组各设3个重复，发酵周期26天。
表5 试验方案
Table 3.5 Experiment design
处理 月见草质量（g）
农∶污（1∶3） 40
农∶污（1∶1） 40
农∶污（3∶1） 40
月见草 40
1.5数据测定
1.5.1沼气及甲烷的测定
沼气每天定时使用排水法收集，并采用量筒测量。甲烷的测定采用南京仁华GC-9890A气相色谱仪，TDX-02B色谱柱（￠4mm×0.5m），以H2为载气，载气流量30 mL/min，TCD检测器进行分析，柱温100℃，检测器温度120℃，进样量为0.5 mL，采用外标法测定样品中的甲烷含量。
1.5.2总固体含量(TS)、挥发性固体含量(VS)测定
测定原理：植物经低温碳化和高温灼烧后氧化，使碳水化合物等有机物分解并以二氧化碳和水的形式挥发而消失，其烧失量即为有机物总量，剩下不可燃烧的残渣为灰分元素的氧化物，称量后即可计算挥发性固体含量(VS)的质量分数。
操作步骤：将瓷坩埚置于马弗炉中525℃±10℃温度下灼烧30min，取出后稍冷，移入干燥器内平衡30min，取出称量记录重量。再放入马弗炉中525℃±10℃灼烧10min后取出，冷却称量，直至两次质量之差小于0.5mg即为恒量M0。将待测样放入已知质量的25mL瓷坩埚中，在105℃±2℃的电热恒温箱中烘烤8h，取出后放入干燥器内平衡30min，称量即为M1。在电炉上（坩埚盖斜放）缓慢碳化，逐步提高电炉温度，直到不再出现黑烟，并且样品呈现出灰白色为止。将坩埚移入马弗炉（盖斜放）于525℃±10℃灼烧2h，取出后稍加冷却，移入干燥器中平衡30min，称量即为M2。
由下式计算得出总固体含量(TS)含量。
总固体(TS)量%(烘干基)=(M1－M2)/(M1－M0)*100
挥发性固体(VS)总量%(烘干基)=(M2－M0)/(M1－M0)*100
式中：M0——坩埚质量，g；
M1——灼烧前瓷坩埚及内容物质量，g；
M2——灼烧后瓷坩埚及内容物质量，g。
1.5.3碳氮比（C/N）测定
有机碳含量测定：采用重铬酸钾氧化-外加热法(Clesceri 等，2005)；测定原理：利用浓硫酸和重铬酸钾迅速混合时所产生的热量来氧化有机质，剩余的重铬酸钾用硫酸亚铁来滴定，通过所消耗的重铬酸钾的量来计算有机碳的含量。由于产生的热量温度较低，对有机质氧化程度较低，只有77%，因此将测得的有机质需要乘以校正系数1.33。
操作步骤：准确称取0.2000g样品于500mL三角瓶中，然后准确加入1N K2Cr2O7溶液10mL，混合均匀后加入浓硫酸20mL，混匀，放置于常温下30min，加水稀释至250mL，加入3-4滴邻啡罗啉，用0.5N FeSO4溶液滴定，溶液颜色由绿色到暗绿色直至成砖红色。用同样的方法做空白测定（不加样品）。
由下式计算出有机碳的含量。
式中：V1—滴定空白样所用FeSO4溶液毫升数；
V2—滴定样品所用FeSO4溶液毫升数；
c—所用FeSO4溶液的当量浓度；
0.003—为1个毫克当量碳的克数；
1.33—氧化矫正系数；
1.724—有机碳转化为有机质的平均换算系数；
m—样品干重(g)。
全氮含量测定：采用H2SO4-H2O2消煮，蒸馏定氮法(Clesceri 等，2005)。操作原理：植物样品在浓硫酸溶液中，经过脱水碳化、氧化等一系列作用，而氧化剂H2O2在热浓硫酸溶液中分解出的新生态氧化【H2O2→H2O2+[O]】具有强烈的氧化作用，分解H2SO4没有破坏的有机物和碳，使有机氮、磷等转化为无机铵盐和磷酸盐等，因此可以在同一消煮液中分别测得N、P、K等元素。
操作步骤：称取磨细烘干的植物样品（过0.25-0.5mm筛）0.1000-0.2000g，置于消煮管中，先用水湿润样品，然后加浓H2SO4 5mL，轻轻摇匀（最好放置过夜），在消煮炉上先通过低温缓缓加热，待浓硫酸分解冒白烟后逐渐升高温度。当溶液全部呈现棕黑色时，从消煮炉上取下消煮管，稍加冷却后，逐滴加入300g/L H2O2 10滴，并不断摇动消煮管（应直接滴入瓶底溶液中，若滴在瓶壁上，H2O2会很快分解，失去氧化效果），以便反应充分进行。再加热至微沸10-20min，稍冷后再加入H2O2 5-10滴。如此反复2-3次，直至消煮液呈无色或清亮色后，再加热5-10min，以除尽过剩的双氧水（否则会影响测定）。冷却后，将消煮液用超纯水定容至100mL，取过滤液供全氮含量的测定。消煮时应同时做空白试验以校正试剂误差。取过滤后的消煮液10mL于洗净干燥后的消煮管中， 将消煮管放入定氮仪中蒸馏。在250mL锥形瓶中，加入 20 g/L H3BO3指示剂混合液20mL，放在冷凝管末端收集蒸馏液。用0.01 mol/L（1/2 H2SO4）标准溶液滴定馏出液由蓝绿色至刚变为紫红色。记录所用酸标准溶液的体积（mL）。空白测定所用酸标准溶液的体积，一般不得超过0.4mL。
由下式计算出全氮的含量。
式中：V—滴定试液时所用酸标准溶液的体积（mL）；
V0—滴定空白时所用酸标准溶液的体积（mL）；
c—0.01 mol/L（1/2 H2SO4）标准溶液的浓度；
14.0—氮原子的摩尔质量（g/mol）;
10-3—将mL换算成L；
m—烘干土样的质量（g）；
n—消煮液定容体积/所取蒸馏液体积。
2 结果与分析
2.1三种污泥产气特性的比较
图2为三种污泥活化过程的厌氧发酵每日产气量曲线图。不同的污泥活化过程日产气量的产气规律不同。污水处理厂污泥在第3d开始，日产气量就维持在300mL左右，农科院污泥从第2d开始，日产气量始终保持在200mL左右，河道污泥日产气量前期始终维持在一个较低的水平，直至12d日产气量达到200mL后，才逐渐趋于稳定。
图3为三种污泥活化过程的厌氧发酵累积产气量的示意图。活化过程共持续了17d，它们的累积产气量大小依次为污水处理厂污泥（4809mL）＞农科院污泥（3232mL）＞河道污泥（2639mL）。
图4是三种污泥活化过程的厌氧发酵甲烷含量的曲线图。污水处理厂污泥在第5d甲烷含量即达到了50%，农科院污泥甲烷含量达到50%的时间为第12d，而河道污泥直至15d甲烷含量才达到了50%。
综上可得，污水处理厂污泥相对于沼气工程沼渣和河道污泥是一种好的易于驯化厌氧发酵接种物。
图2 不同污泥厌氧发酵的累积产气量
Figure 3.1 Cumulative biogas production of different sludges during anaerobic digestion.
图3 不同污泥厌氧发酵的累积产气量
Figure 3.2 Cumulative biogas production of different sludges during anaerobic digestion.
图4 不同污泥厌氧发酵的甲烷含量
Figure 3.3 CH4 content of different sludges during 50 days’ anaerobic fermentation.
2.2 不同浓度铜离子对厌氧发酵的影响
四组处理厌氧发酵46 d的日产气量如图5所示，A、B两组的日产气量趋势类似，C、D两组的日产气量曲线类似。4个处理均在厌氧发酵初期（4d左右）出现一个日产气量高峰，其中，A、B两组的日产气量峰值接近，C、D两组的日产气量峰值接近。这就说明虽然在进行厌氧发酵前，四组处理的接种物均已活化，但是活化时加入不同浓度的铜确实对厌氧发酵产生了影响，铜浓度越高，对发酵的影响越大。
厌氧发酵46 d各处理的累积产气量如下图所示，可以看出，累积产气量的大小依次为B（8344mL）＞A（7336mL）＞C（5364mL）＞D（5245mL）。根据第二章的研究结果，100 mg/kg 铜对厌氧发酵有促进作用，所以在接种物中加入100 mg/kg 铜进行活化后，同样对厌氧发酵有促进作用。
A:污泥 B: 污泥+100mg/kg硫酸铜 C: 污泥+500mg/kg硫酸铜 D: 污泥+1000mg/kg硫酸铜
图5 不同处理植物厌氧发酵的日产气量
Figure5 Daily biogas production of different treatments during anaerobic digestion.
A:污泥 B: 污泥+100mg/kg硫酸铜 C: 污泥+500mg/kg硫酸铜 D: 污泥+1000mg/kg硫酸铜
图6 不同处理植物厌氧发酵的累积产气量
Figure 6 Cumulative biogas production of different treatments during anaerobic digestion.
2.3不同比例的混合污泥发酵特点
图7为农科院污泥和污水处理厂污泥不同配比厌氧发酵每日产气量示意图。不同处理日产气量呈现出相似的变化规律，但是，可以看出启动时间最短的是农∶污（1∶3）。各处理均在第6d左右出现日产气量峰值，随后缓慢下降，趋于稳定。
图8为农科院污泥和污水处理厂污泥不同配比厌氧发酵累积产气量曲线图。经过26d的厌氧发酵过程，四组处理的累积产气量分别为（农︰污 1:3）（9282mL）﹥（农︰污 1:1）（7832mL）﹥（农︰污 3:1）（6963mL）﹥月见草（6825mL）。根据统计学分析结果，可以发现累积产气（农：污 1:3）和（农︰污 1:1）差异显著，（农︰污 1:1）与（农︰污 3:1）和月见草差异显著，（农︰污 3:1）和月见草处理之间差异不显著。说明农︰污 1:3和农︰污 1:3对于月见草污泥发酵具有促进作用，农︰污 3:1对厌氧发酵无影响。
图7 不同处理植物厌氧发酵的日产气量
Figure 7 Daily biogas production of different treatments during anaerobic digestion.
图8 不同处理植物厌氧发酵的累积产气量
Figure 8 Cumulative biogas production of different treatments during anaerobic digestion.
图9 不同处理厌氧发酵的甲烷含量
Figure 9 CH4 content of different treatments during 50 days’ anaerobic fermentation.
表6 不同处理累积产气量的差异显著性分析
Table 6. Effects of the cumulative gas production of different treatments after 30 days of anaerobic digestion
处理 累积产气量
农∶污（1∶3） 9310±248 a
农∶污（1∶1） 7820±156 b
农∶污（3∶1） 6933±153 c
月见草 6833±115 b
注：不同处理间不同小写字母表示有显著差异（P＜0.05）
总结与讨论
从上述试验中可以发现污水处理厂污泥相对于其他两种污泥是较易被驯化。污水处理厂污泥驯化时间需要7d左右，农科院污泥为12d，河道污泥为14d。其中，污泥配比农∶污为1∶3和农∶污为1∶1对于月见草厌氧发酵具有促进作用。在污泥驯化的过程中添加100ppm的Cu2+，对月见草厌氧发酵有促进作用。
但是试验中依然存在问题需要进一步改进与研究。如试验未使用原位的重金属污染土壤修复植物作为发酵底物，对试验的结果说服力不强。还有试验仅仅在实验室进行了小规模的试验，未进行规模更大的中试，对于今后的应用缺乏必要的数据。在今后的实验中也可以扩大筛选污泥的种类，不同污泥之间配比的不同组合亦可相应得增加，以期能得到更加合理有效的驯化方案。
致谢
参考文献
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关键字:
目录
摘要 2
关键字 2
Abstract 2
Key words 2
引言: 2
1 材料与方法 3
1.1 试验装置 3
1.2不同接种物厌氧发酵产沼气效果的比较 3
1.2.1试验材料 3
1.2.2实验方法 4
1.3污泥的初步驯化 4
1.3.1 试验材料 4
1.3.2 试验方法 4
1.4铜污染土壤修复植物材料厌氧发酵接种物的驯化 5
1.4.1 试验材料 5
1.4.2 试验方法 5
1.5数据测定 5
1.5.1沼气及甲烷的测定 5
1.5.2总固体含量(TS)、挥发性固体含量(VS)测定 5
1.5.3碳氮比（C/N）测定 6
2 结果与分析 7
2.1三种污泥产气特性的比较 7
2.2 不同浓度铜离子对厌氧发酵的影响 9
2.3不同比例的混合污泥发酵特点 10
总结与讨论 12
致谢 13
参考文献 13
铜污染土壤修复植物厌氧发酵接种物的初步筛选和驯化研究
引言
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