小鼠骨髓间充质干细胞的分离与鉴定
小鼠骨髓间充质干细胞的分离与鉴定[20200614171535]
摘要：间充质干细胞(Mesenchymal stem cell, MSC)是一种广泛分布于动物和人的骨髓、脂肪、肝脏等组织中的成体干细胞，其不仅具有自我增殖和多向分化潜能，更具有其他干细胞所不具备的免疫调节功能，近年来，其在免疫生物学治疗中的应用逐渐得到关注。目前MSC的研究建立在对其的有效分离及体外扩增上，常使用小鼠作为实验模型对其骨髓间充质干细胞进行有效的分离以及体外培养，用于体外研究。鉴此，本课题旨在通过全骨髓贴壁法分离出小鼠中的骨髓间充质干细胞，体外培养后对其表面分子标记及分化潜能进行鉴定，同时检测其免疫调节功能，为进一步深入探索MSC免疫调节功能及分化潜能在疾病治疗中的作用及机制提供研究材料。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
关键字:骨髓间充质干细胞；分离鉴定；表面标记；分化潜能；免疫调节功能
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 材料 2
1．1．1 实验动物 2
1．1．2 主要实验试剂及培养基 2
1．1．3 主要仪器设备 2
1．2 方法 3
1．1．1 小鼠骨髓细胞的分离与培养 3
1．1．2 成骨诱导分化 3
1．1．3 成脂诱导分化 3
1．1．4 细胞表面标记鉴定 4
1．1．5 MSC的免疫调节功能 4
2 结果与分析 5
2．1 骨髓间充质干细胞形态学观察 5
2．2 骨髓间充质干细胞的鉴定 6
2．2．1 细胞成骨分化 6
2．2．2 细胞成脂分化 6
2．2．2 细胞表面标记鉴定 7
2．3 骨髓间充质干细胞的免疫调节作用 8
3 讨论 10
3．1 关于小鼠骨髓间充质干细胞分离技术 10
3．2 关于间充质干细胞的多向分化潜能 10
3．3 关于MSC的免疫调节功能 10
3．4 关于MSC在疾病治疗中的作用 10
3．5 关于后续工作 10
致谢 11
参考文献： 11
小鼠骨髓间充质干细胞的分离与鉴定
引言
引言：间充质干细胞（mesenchymal stem cell, MSC）作为干细胞的一员，可以分化成多种细胞，如骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
[1]。除此之外，它还具有其他干细胞所不具备的免疫调节功能以及低免疫原性[2]。MSC存在于多种组织中，包括骨髓、胎盘、脐带等，其中骨髓是人们最早发现MSC的地方。随着相关研究的不断深入，人们对MSC的了解也更为全面，其在临床应用上的价值也不断显露。目前，包括心脏系统疾病、神经系统疾病、自身免疫性疾病以及骨损伤等疾病在内的多种疾病已经将MSC作为一种前景广阔的治疗手段进行临床研究，大多都取得了令人欣喜的结果[3]。
在对间充质干细胞进行实验研究时，由于从骨髓中分离间充质干细胞的技术比较成熟，人们常使用骨髓来源的MSC[4]作为实验材料。同时因为骨髓中MSC的含量较低，只有不到0.1%，人们常使用小鼠作为实验模型，对其骨髓来源的MSC进行分离纯化，体外培养，深入研究MSC相关特性。
目前国内外公认的骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell, BM-MSC）分离方法有以下几种，包括密度梯度离心法、全骨髓贴壁培养法、表面标记筛选法以及纤维蛋白微珠法[1]。其中最为常用的为前两种方法。对于骨髓间充质干细胞的鉴定，现在使用的主要依据有：BM-MSC的表面标记以及其多向分化能力（主要是成骨分化与成脂分化能力）[5]。但是由于BM-MSC在体外培养过程中表面标记发生一定的变化，因此目前对于其表面标记还存在一定的争议，最近新发现表明血小板源性生长因子-α（PDGFR-α）以及干细胞抗原1（Sca-1）可以作为BM-MSC的有效分子标记[6]。目前主要认可的用于BM-MSC鉴定的表面标记有CD34、CD44、CD11b、CD45等[7]。
MSC具有易取材、易培养、抗原性弱、可以从患者本人直接取材避免移植排斥反应等特征，这些特征赋予了MSC在多种疾病治疗中重要的研究价值和广泛的应用前景[8]。而高效率地获取高纯度、功能正常的MSC是深入研究MSC应用价值的重要前提条件，鉴此，本课题首先对小鼠骨髓中的MSC进行分离培养及鉴定，是为后续研究MSC的功能提供实验材料，创造研究条件。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 实验动物 C57BL/6种系小鼠（雄性，3周），购于中国科学院上海实验动物中心，饲养于上海交通大学医学院动物科学部屏障环境内。
1．1．2 主要实验试剂及培养基 DMEM基础培养基：低糖型DMEM培养基（Hyclone），10%的胎牛血清（Gibco），2mmol/L的GlutaMAX试剂（Invitrogen），100U/mL青霉素（Invitrogen），100μg/mL链霉素（Invitrogen）。
OriCellTM C57BL/6小鼠成骨诱导分化培养基：175mL C57BL/6小鼠间充质干细胞成骨分化基础培养基，20mL胎牛血清，2mL青-链霉素，2mL谷氨酸盐，400μL抗坏血酸盐，2mLβ-甘油磷酸盐，20μL地塞米松。（购于Cyagen Biosciences Inc.）
OriCellTM C57BL/6小鼠成脂诱导分化培养基：
（1）C57BL/6小鼠间充质干细胞成脂分化培养基A：175mL C57BL/6小鼠间充质干细胞成脂分化基础培养基A，20mL胎牛血清，2mL青-链霉素，2mL谷氨酸盐，200μL胰岛素，200μL的3-异丁 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
基-1-甲基黄嘌呤，200μL吲哚美辛，200μL地塞米松。
（2）C57BL/6小鼠间充质干细胞成脂分化培养基B：175mL C57BL/6小鼠间充质干细胞成脂分化基础培养基B，20mL胎牛血清，2mL青-链霉素，2mL谷氨酸盐，200μL胰岛素。（购于Cyagen Biosciences Inc.）
抗体：CD44-APC、c-kit-FITC、Sca-1-APC、CD45.2-FITC、MHCⅡ-PE、CD11b-PECy7、CD34-FITC、Thy1.2-PECy5。购于eBioscience。
PBS缓冲液：4.775g粉剂，加入双蒸水定容至500mL。
4%的多聚甲醛溶液：20g粉剂，PBS溶液定容至500mL。
茜素红溶液：购于Cyagen Biosciences Inc.
油红O染色试剂盒：购于Cyagen Biosciences Inc.
Trypsin-EDTA混合液：0.25%的胰酶与0.02%的EDTA，使用PBS缓冲液进行溶解。
闪烁液：2，5二苯基噁唑（PPO） 5.00g；1，4-双2（5-苯基噁唑基）苯（POPOP）0.30g；无水乙醇200ml；甲苯800ml
1．1．3 主要仪器设备 CO2培养箱（Thermo）；超净工作台（Thermo）；倒置显微镜（Olympus）；流式细胞仪（BD Aria）；高速离心机（Hitachi）；荧光显微镜（Nikon）；闪烁计数仪（Wallac）； Western blot 电泳槽（Bio-Rad）；蛋白电泳转膜仪器（Bio-Rad）；冲片机（MultiLine 400）
1．2 方法
1．1．1 小鼠骨髓细胞的分离与培养
取小鼠2只，采用颈椎脱臼法将其处死，浸泡于75%的酒精中。在超净台上解剖小鼠，取出小鼠后肢胫骨及股骨，注意将肌肉剔除干净并保持骨头完整性。使用一次性医用注射针吸取已配好的DMEM基础培养基，冲洗出骨髓中的细胞，同一只小鼠的细胞置于同一个10cm的平板中培养。在平板上标记号细胞种类、代数、日期以及姓名。将平板置于37℃，5%CO2浓度的培养箱中培养。
摘要：间充质干细胞(Mesenchymal stem cell, MSC)是一种广泛分布于动物和人的骨髓、脂肪、肝脏等组织中的成体干细胞，其不仅具有自我增殖和多向分化潜能，更具有其他干细胞所不具备的免疫调节功能，近年来，其在免疫生物学治疗中的应用逐渐得到关注。目前MSC的研究建立在对其的有效分离及体外扩增上，常使用小鼠作为实验模型对其骨髓间充质干细胞进行有效的分离以及体外培养，用于体外研究。鉴此，本课题旨在通过全骨髓贴壁法分离出小鼠中的骨髓间充质干细胞，体外培养后对其表面分子标记及分化潜能进行鉴定，同时检测其免疫调节功能，为进一步深入探索MSC免疫调节功能及分化潜能在疾病治疗中的作用及机制提供研究材料。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
关键字:骨髓间充质干细胞；分离鉴定；表面标记；分化潜能；免疫调节功能
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 材料 2
1．1．1 实验动物 2
1．1．2 主要实验试剂及培养基 2
1．1．3 主要仪器设备 2
1．2 方法 3
1．1．1 小鼠骨髓细胞的分离与培养 3
1．1．2 成骨诱导分化 3
1．1．3 成脂诱导分化 3
1．1．4 细胞表面标记鉴定 4
1．1．5 MSC的免疫调节功能 4
2 结果与分析 5
2．1 骨髓间充质干细胞形态学观察 5
2．2 骨髓间充质干细胞的鉴定 6
2．2．1 细胞成骨分化 6
2．2．2 细胞成脂分化 6
2．2．2 细胞表面标记鉴定 7
2．3 骨髓间充质干细胞的免疫调节作用 8
3 讨论 10
3．1 关于小鼠骨髓间充质干细胞分离技术 10
3．2 关于间充质干细胞的多向分化潜能 10
3．3 关于MSC的免疫调节功能 10
3．4 关于MSC在疾病治疗中的作用 10
3．5 关于后续工作 10
致谢 11
参考文献： 11
小鼠骨髓间充质干细胞的分离与鉴定
引言
引言：间充质干细胞（mesenchymal stem cell, MSC）作为干细胞的一员，可以分化成多种细胞，如骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
[1]。除此之外，它还具有其他干细胞所不具备的免疫调节功能以及低免疫原性[2]。MSC存在于多种组织中，包括骨髓、胎盘、脐带等，其中骨髓是人们最早发现MSC的地方。随着相关研究的不断深入，人们对MSC的了解也更为全面，其在临床应用上的价值也不断显露。目前，包括心脏系统疾病、神经系统疾病、自身免疫性疾病以及骨损伤等疾病在内的多种疾病已经将MSC作为一种前景广阔的治疗手段进行临床研究，大多都取得了令人欣喜的结果[3]。
在对间充质干细胞进行实验研究时，由于从骨髓中分离间充质干细胞的技术比较成熟，人们常使用骨髓来源的MSC[4]作为实验材料。同时因为骨髓中MSC的含量较低，只有不到0.1%，人们常使用小鼠作为实验模型，对其骨髓来源的MSC进行分离纯化，体外培养，深入研究MSC相关特性。
目前国内外公认的骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell, BM-MSC）分离方法有以下几种，包括密度梯度离心法、全骨髓贴壁培养法、表面标记筛选法以及纤维蛋白微珠法[1]。其中最为常用的为前两种方法。对于骨髓间充质干细胞的鉴定，现在使用的主要依据有：BM-MSC的表面标记以及其多向分化能力（主要是成骨分化与成脂分化能力）[5]。但是由于BM-MSC在体外培养过程中表面标记发生一定的变化，因此目前对于其表面标记还存在一定的争议，最近新发现表明血小板源性生长因子-α（PDGFR-α）以及干细胞抗原1（Sca-1）可以作为BM-MSC的有效分子标记[6]。目前主要认可的用于BM-MSC鉴定的表面标记有CD34、CD44、CD11b、CD45等[7]。
MSC具有易取材、易培养、抗原性弱、可以从患者本人直接取材避免移植排斥反应等特征，这些特征赋予了MSC在多种疾病治疗中重要的研究价值和广泛的应用前景[8]。而高效率地获取高纯度、功能正常的MSC是深入研究MSC应用价值的重要前提条件，鉴此，本课题首先对小鼠骨髓中的MSC进行分离培养及鉴定，是为后续研究MSC的功能提供实验材料，创造研究条件。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 实验动物 C57BL/6种系小鼠（雄性，3周），购于中国科学院上海实验动物中心，饲养于上海交通大学医学院动物科学部屏障环境内。
1．1．2 主要实验试剂及培养基 DMEM基础培养基：低糖型DMEM培养基（Hyclone），10%的胎牛血清（Gibco），2mmol/L的GlutaMAX试剂（Invitrogen），100U/mL青霉素（Invitrogen），100μg/mL链霉素（Invitrogen）。
OriCellTM C57BL/6小鼠成骨诱导分化培养基：175mL C57BL/6小鼠间充质干细胞成骨分化基础培养基，20mL胎牛血清，2mL青-链霉素，2mL谷氨酸盐，400μL抗坏血酸盐，2mLβ-甘油磷酸盐，20μL地塞米松。（购于Cyagen Biosciences Inc.）
OriCellTM C57BL/6小鼠成脂诱导分化培养基：
（1）C57BL/6小鼠间充质干细胞成脂分化培养基A：175mL C57BL/6小鼠间充质干细胞成脂分化基础培养基A，20mL胎牛血清，2mL青-链霉素，2mL谷氨酸盐，200μL胰岛素，200μL的3-异丁 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
基-1-甲基黄嘌呤，200μL吲哚美辛，200μL地塞米松。
（2）C57BL/6小鼠间充质干细胞成脂分化培养基B：175mL C57BL/6小鼠间充质干细胞成脂分化基础培养基B，20mL胎牛血清，2mL青-链霉素，2mL谷氨酸盐，200μL胰岛素。（购于Cyagen Biosciences Inc.）
抗体：CD44-APC、c-kit-FITC、Sca-1-APC、CD45.2-FITC、MHCⅡ-PE、CD11b-PECy7、CD34-FITC、Thy1.2-PECy5。购于eBioscience。
PBS缓冲液：4.775g粉剂，加入双蒸水定容至500mL。
4%的多聚甲醛溶液：20g粉剂，PBS溶液定容至500mL。
茜素红溶液：购于Cyagen Biosciences Inc.
油红O染色试剂盒：购于Cyagen Biosciences Inc.
Trypsin-EDTA混合液：0.25%的胰酶与0.02%的EDTA，使用PBS缓冲液进行溶解。
闪烁液：2，5二苯基噁唑（PPO） 5.00g；1，4-双2（5-苯基噁唑基）苯（POPOP）0.30g；无水乙醇200ml；甲苯800ml
1．1．3 主要仪器设备 CO2培养箱（Thermo）；超净工作台（Thermo）；倒置显微镜（Olympus）；流式细胞仪（BD Aria）；高速离心机（Hitachi）；荧光显微镜（Nikon）；闪烁计数仪（Wallac）； Western blot 电泳槽（Bio-Rad）；蛋白电泳转膜仪器（Bio-Rad）；冲片机（MultiLine 400）
1．2 方法
1．1．1 小鼠骨髓细胞的分离与培养
取小鼠2只，采用颈椎脱臼法将其处死，浸泡于75%的酒精中。在超净台上解剖小鼠，取出小鼠后肢胫骨及股骨，注意将肌肉剔除干净并保持骨头完整性。使用一次性医用注射针吸取已配好的DMEM基础培养基，冲洗出骨髓中的细胞，同一只小鼠的细胞置于同一个10cm的平板中培养。在平板上标记号细胞种类、代数、日期以及姓名。将平板置于37℃，5%CO2浓度的培养箱中培养。
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/swgc/smkx/475.html
