黑麦草内生真菌及其波胺合成基因的检测
：多种多年生黑麦草中含有内生真菌Neotyphodium lolii，并因此获得优良性状；而对一年生黑麦草内生真菌的种类，甚至有无，知之甚少。本文对3个种的黑麦草种子和叶鞘内的内生真菌做了初步的检测，与N. sinicum和E. yangzii等鹅观草内生真菌及早熟禾内生真菌，进行对比，观察其形态学差异。通过对植物组总DNA的提取，利用波胺合成基因引物perA-F/perA-R对目的基因进行PCR扩增，得到目的基因片段，并进行测序。根据测得的序列，在NCBI 网站通过BLAST 软件进行比对，确认片段。选择近缘真菌菌株的对应基因片段的序列，用最大简约法进行系统发育学分析。通过形态学和基因检测，发现一种黑麦草中含有内生真菌，并推断出其具有合成波胺的潜力。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法1
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.1草种的收集、保藏与栽培2
1.2.2植物的采集、保藏与鉴别3
1.2.3内生真菌的检测3
1.2.4植物基因组DNA的提取和检测3
1.2.5 PCR扩增4
2结果与分析5
2.1内生真菌的检测5
2.1.1种子内的内生真菌5
2.1.2植物叶鞘和茎髓内的内生真菌6
2.2植物基因组DNA的提取与检测6
2.3植物内生真菌基因序列的PCR扩增7
2.4序列分析8
3讨论 9
致谢10
参考文献10
黑麦草内生真菌及其波胺合成基因的检测
引言
引言
绝大部分情况下可以认为，内生真菌特指生活在早熟禾亚科(Po?ideae)冷季型植物中的epichlo? 类内生真菌[1, 2]，包含 Neotyphodium 属和 Epichlo?属。Epichlo?属内生真菌的子囊孢子从子座内的子囊壳中喷射而出，萌发产生的菌丝侵入临近植株花的柱头或被截断的空心秆中，进行水平传播。Neotyphodium 内生真菌则
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
不产生有性阶段，仅进行垂直传播，菌丝在宿主早期发育过程中侵入胚胎[3]。
研究发现，内生真菌具有促进宿主植物的生长，在低氮条件下，能增加宿主对氮元素的吸收[4]。除此之外，内生真菌能产生植物生长激素以及增强宿主植物的抗干旱胁迫的能力等作用，增强宿主对病虫害的抵抗能力，比如合成生物碱波胺[5,6]。
目前，苇状羊茅（L. arundinaceum）和多年生黑麦草（L. perenne）携带的内生真菌 N. coenophialum和 N. lolii的研究在国际上正日益受到重视[7]。这使得国际上许多牧场、草坪种子公司开始利用含有内生真菌的草种，来增强草坪对环境胁迫的耐受力和抗虫害能力。
另外，有研究表明，内生真菌产生的代谢产物可引起家畜食用后中毒现象[8,9]。Fletcher和 Harvey首次发现 N. lolii与羊的黑麦草蹒跚病（Ryegrass stagger）有直接关系[10]。N. coenophialum和N. lolii曾给美国、新西兰等国家的畜牧业造成巨大经济损失[2,11]。
由于大部分内生真菌终生存在于宿主体内，使人们对黑麦草内生真菌的生物学特征了解甚少，国内这方面的报道也较少。虽然我国牧草种植利用过程中出现象欧美那样家畜采食中毒现象尚未见报道，但随着草业国际化引种频繁，确实值得警惕。国内对内生
真菌的检测鉴定研究起步较晚，还有巨大的领域值得探索。
本论文中对一年生和多年生黑麦草的种子和叶鞘内的内生真菌做了进行检测，与N. sinicum和E. yangzii等鹅观草内生真菌及早熟禾内生真菌，进行形态学及基因检测对比，以获得黑麦草中内生真菌的形态学及生物碱合成的基础信息。
1 材料与方法
1．1 材料
供试草种：黑麦草草种（L. perenne / L. multiflorum/ L. pratensis）和鹅观草草种（Roegneria kamoji），为2014年9月至12月期间，本实验室保藏或从生物公司购买及由草业学院赠送获得（表1）。
供试植株：黑麦草（L. perenne/L. multiflorum/ L. pratensis）、鹅观草（R. kamoji）、早熟禾（Poa sp.），2015年3月至5月本实验室种植和采集自大学卫岗校区、美林苑小区和大学牌楼试验田（表2）。
本论文使用试剂未做特殊说明，均购自南京市寿德实验器材有限公司。
表1 本研究中所用的供试草种信息
种类
品名
年份
来源
多花黑麦草Lolium multiflorum
冬鹰
2014
本实验室
Angus 1#
2014
北京正道公司
牧谣
2014
本实验室
多年生黑麦草L. perenne
邦德
2014
北京正道公司
Bnune Vista
2014
南农大草业学院
尚品
2014
北京正道公司
维纳斯
2014
北京克劳沃公司
草甸黑麦草 L. pratensis
Harusakae
2014
日本
鹅观草R. kamoji
2014
本实验室
表2 本研究中所用的供试植株信息
植株
年份
采集地
L. multiflorum.（Harusakae）
2015
本实验室种植
L. perenne（Bnune Vista）
2015
本实验室种植
L. perenne
2015
南农大主楼草坪
R. kamoji
2015
本实验室种植
R. kamoji
2015
南农大牌楼试验田
Poa sp.
2015
美林苑小区
1．2 方法
1．2．1 草种的收集、保藏与栽培
将所有购买和收集来的供试草种干燥后，4 ℃冰箱中冷藏保存。正常情况下，可保存2~3年。但为了实验结果更为精确，本论文所使用的供试草种均为2014年的新种。
选择草甸黑麦草Harusakae和Bnune Vista多年生黑麦草草种进行实验室栽培。用95% C2H5OH消毒草种20 min，换上去离子水在培养皿中浸种，50粒/皿，25 ℃恒温培养。种子露白后移栽入盆钵中，30颗/盆，置于大棚。
1．2．2 植物的采集、保藏与鉴别
2015 年 3月起分别从大学卫岗校区、美林苑小区和大学牌楼试验田采集供试样品。黑麦草样品则从实验室直接可获得。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法1
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.1草种的收集、保藏与栽培2
1.2.2植物的采集、保藏与鉴别3
1.2.3内生真菌的检测3
1.2.4植物基因组DNA的提取和检测3
1.2.5 PCR扩增4
2结果与分析5
2.1内生真菌的检测5
2.1.1种子内的内生真菌5
2.1.2植物叶鞘和茎髓内的内生真菌6
2.2植物基因组DNA的提取与检测6
2.3植物内生真菌基因序列的PCR扩增7
2.4序列分析8
3讨论 9
致谢10
参考文献10
黑麦草内生真菌及其波胺合成基因的检测
引言
引言
绝大部分情况下可以认为，内生真菌特指生活在早熟禾亚科(Po?ideae)冷季型植物中的epichlo? 类内生真菌[1, 2]，包含 Neotyphodium 属和 Epichlo?属。Epichlo?属内生真菌的子囊孢子从子座内的子囊壳中喷射而出，萌发产生的菌丝侵入临近植株花的柱头或被截断的空心秆中，进行水平传播。Neotyphodium 内生真菌则
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
不产生有性阶段，仅进行垂直传播，菌丝在宿主早期发育过程中侵入胚胎[3]。
研究发现，内生真菌具有促进宿主植物的生长，在低氮条件下，能增加宿主对氮元素的吸收[4]。除此之外，内生真菌能产生植物生长激素以及增强宿主植物的抗干旱胁迫的能力等作用，增强宿主对病虫害的抵抗能力，比如合成生物碱波胺[5,6]。
目前，苇状羊茅（L. arundinaceum）和多年生黑麦草（L. perenne）携带的内生真菌 N. coenophialum和 N. lolii的研究在国际上正日益受到重视[7]。这使得国际上许多牧场、草坪种子公司开始利用含有内生真菌的草种，来增强草坪对环境胁迫的耐受力和抗虫害能力。
另外，有研究表明，内生真菌产生的代谢产物可引起家畜食用后中毒现象[8,9]。Fletcher和 Harvey首次发现 N. lolii与羊的黑麦草蹒跚病（Ryegrass stagger）有直接关系[10]。N. coenophialum和N. lolii曾给美国、新西兰等国家的畜牧业造成巨大经济损失[2,11]。
由于大部分内生真菌终生存在于宿主体内，使人们对黑麦草内生真菌的生物学特征了解甚少，国内这方面的报道也较少。虽然我国牧草种植利用过程中出现象欧美那样家畜采食中毒现象尚未见报道，但随着草业国际化引种频繁，确实值得警惕。国内对内生
真菌的检测鉴定研究起步较晚，还有巨大的领域值得探索。
本论文中对一年生和多年生黑麦草的种子和叶鞘内的内生真菌做了进行检测，与N. sinicum和E. yangzii等鹅观草内生真菌及早熟禾内生真菌，进行形态学及基因检测对比，以获得黑麦草中内生真菌的形态学及生物碱合成的基础信息。
1 材料与方法
1．1 材料
供试草种：黑麦草草种（L. perenne / L. multiflorum/ L. pratensis）和鹅观草草种（Roegneria kamoji），为2014年9月至12月期间，本实验室保藏或从生物公司购买及由草业学院赠送获得（表1）。
供试植株：黑麦草（L. perenne/L. multiflorum/ L. pratensis）、鹅观草（R. kamoji）、早熟禾（Poa sp.），2015年3月至5月本实验室种植和采集自大学卫岗校区、美林苑小区和大学牌楼试验田（表2）。
本论文使用试剂未做特殊说明，均购自南京市寿德实验器材有限公司。
表1 本研究中所用的供试草种信息
种类
品名
年份
来源
多花黑麦草Lolium multiflorum
冬鹰
2014
本实验室
Angus 1#
2014
北京正道公司
牧谣
2014
本实验室
多年生黑麦草L. perenne
邦德
2014
北京正道公司
Bnune Vista
2014
南农大草业学院
尚品
2014
北京正道公司
维纳斯
2014
北京克劳沃公司
草甸黑麦草 L. pratensis
Harusakae
2014
日本
鹅观草R. kamoji
2014
本实验室
表2 本研究中所用的供试植株信息
植株
年份
采集地
L. multiflorum.（Harusakae）
2015
本实验室种植
L. perenne（Bnune Vista）
2015
本实验室种植
L. perenne
2015
南农大主楼草坪
R. kamoji
2015
本实验室种植
R. kamoji
2015
南农大牌楼试验田
Poa sp.
2015
美林苑小区
1．2 方法
1．2．1 草种的收集、保藏与栽培
将所有购买和收集来的供试草种干燥后，4 ℃冰箱中冷藏保存。正常情况下，可保存2~3年。但为了实验结果更为精确，本论文所使用的供试草种均为2014年的新种。
选择草甸黑麦草Harusakae和Bnune Vista多年生黑麦草草种进行实验室栽培。用95% C2H5OH消毒草种20 min，换上去离子水在培养皿中浸种，50粒/皿，25 ℃恒温培养。种子露白后移栽入盆钵中，30颗/盆，置于大棚。
1．2．2 植物的采集、保藏与鉴别
2015 年 3月起分别从大学卫岗校区、美林苑小区和大学牌楼试验田采集供试样品。黑麦草样品则从实验室直接可获得。
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