磷脂酶c对灵芝菌丝生长和次生代谢的影响
：灵芝（Ganoderma lucidum）是传统的大型药用真菌，具有抗衰老、提高免疫、降血脂和抗肿瘤等功效。灵芝此生代谢产物中的灵芝三萜是灵芝的主要药用成分，研究价值非常高。外界环境能够显著影响灵芝三萜的生物合成。磷脂酶C，全称磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C（PI-PLC），本研究中通过沉默灵芝PLC基因来解析PLC调控灵芝菌丝生长和次生代谢（主要是灵芝三萜）的机制。最终实验结果表明：PLC基因显著影响菌丝生长，PLC沉默菌株与野生型相比，生长速率下降40%-60%，最终菌落半径也缩减50%左右；同时PLC基因对灵芝次级代谢产物三萜的合成也有重要的影响，PLC沉默菌株三萜合成下调。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 实验材料 2
1.1.1 供试菌株 2
1.1.2 培养基 2
1.1.3 主要试剂与溶液 2
1.1.4 主要仪器设备 2
1.2 实验方法 3
1.2.1菌种平板活化 3
1.2.2生长实验 3
1.2.3液体发酵种子制备 3
1.2.4液体发酵 3
1.2.5生物量统计和三萜测定 3
2 结果与分析 3
2.1 灵芝生长实验结果与分析 3
2.2 灵芝生物量测定的结果与分析 5
2.3 灵芝菌丝内三萜含量测定的结果与分析 6
3 讨论 7
3.1 PLC基因对灵芝菌丝生长的影响 7
3.2 PLC基因对灵芝三萜合成的影响 7
致谢 7
参考文献 7
磷脂酶C对灵芝菌丝生长和次生代谢的影响
生物学基地班 韩贤舟
引言
引言
灵芝（Ganoderma lucidum）为大型高等担子菌，在分类学上属于真菌界、真核真菌亚界、真菌门、担子菌亚门、层菌纲、非褶菌目、灵芝菌科、灵芝属（Ganoderma）。人们通过实践和理论充分的肯定了灵芝的药用
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
价值，现代科学研究发现灵芝次生代谢产物灵芝三萜是其重要的药用成分。
灵芝三萜的生物合成途径被称为甲羟戊酸（MVA）代谢途径，此代谢途径主要在细胞质中，故又名细胞质代谢途径。MVA代谢途径首先是乙酰辅酶A经硫解酶催化缩合形成乙酰乙酰辅酶A，在3羟基3甲基戊二酸单酰辅酶A（HMGCoA）合成酶催化作用下，两分子的乙酰乙酰辅酶A缩合生成HMGCoA。生成的HMGCoA由 HMGCoA还原酶催化转变为甲羟戊酸。甲羟戊酸经甲羟戊酸 5磷酸激酶（PMK）和甲羟戊酸脱羧酶（MVD）以及甲羟戊酸激酶（MVK）等酶促反应转化为法呢酯焦磷酸。之后通过酶的缩合作用、氧化作用合成羊毛甾醇。最后通过细胞色素P450 还原酶（CYP51）将羊毛甾醇催化和侧链修饰合成不同结构的灵芝三萜类物质。
由于灵芝栽培生长期较长，受环境、霉菌和虫害影响大，这些因素严重影响了灵芝品质、产量的稳定性，同时也制约灵芝子实体生物活性物的推广应用。因此，更多的研究工作重点集中在如何提高灵芝菌丝体中的三萜含量。近年来，越来越多的研究者发现通过改变培养条件能够显著提高灵芝菌丝体中三萜的含量。随着对外界因子的探索，研究者发现多种环境因素也能够诱导灵芝三萜生物合成，其中包括一些如茉莉酸甲酯的植物信号分子物质。但目前，灵芝三萜生物合成的调控机理还知之甚少。
磷脂酶C，是一个在胞浆膜上的关键酶，完整名称为称磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C（PIPLC），催化PIP2分解产生1,4,5肌醇三磷酸和二酰甘油（DAG）两个信号分子。本实验将研究磷脂酶C对灵芝菌丝生长和次生代谢的影响。希望本实验可以为揭示灵芝有关次生代谢产物产生的分子机制和灵芝出菇的机理打下分子和理论基础。
细胞膜的重要构成组分之一磷脂酰肌醇，在磷脂酶的作用可以被水解，分解为三磷酸肌醇、磷脂酸、溶血磷脂、二酰基甘油、不饱和脂肪酸等。磷脂酰肌醇不仅可以作为磷脂的合成原料，并且在细胞感受外界刺激及其信号传导过程中也担任着重要的作用。磷脂酰肌醇信号传导途径与光合作用、激素调控等影响植物生长发育过程及抗逆信号传导关系密切，因为这些信号分子的产生直接受磷脂酶的活性的影响，所以磷脂酶在磷脂酰肌醇信号传导途径中是处在一个中心地位的。磷脂酶分类依照的是磷脂水解位点的不同，磷脂酶PLA2、PLC和PLD具有多种同功酶形式，它们分别在植物生长发育的不同阶段及对外界环境因子应答的信号传导过程中担任重要的调节作用。
在大型担子菌灵芝中PLC基因是否会影响灵芝的菌丝生长和次生代谢还不清楚，本研究通过沉默PLC基因的方法来研究PLC在灵芝中的作用与影响。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1.1.1 供试菌株
G20：灵芝野生型菌株（实验室保存）；
CK1、CK2：转入ura3沉默质粒的转化子；
PLC基因沉默菌株：PLCi7、PLCi14、PLCi19。
1.1.2 培养基
PDA培养基（1 L）：葡萄糖 20 g，去皮的马铃薯 200 g，水1000 mL。将马铃薯削去皮，切碎成适当大小的小块，在锅中加入8001000 mL的水，煮沸30分钟，用双层纱布进行过滤，保留滤液，加入糖，最后加水补到1000 mL，pH自然即可。固体培养基则加入20 g琼脂。
CYM培养基（1 L）：1% 麦芽糖，2% 葡萄糖，0.2% Yeast Extract（酵母提取物），0.2% peptone（蛋白胨），0.05% MgSO47H2O，0.46% K2HPO4；若配置固体培养基，则再加入2% Agar（琼脂）。
1.1.3 主要试剂
乙酸、盐酸、高氯酸、95%乙醇、无水乙醇、齐墩果酸、Neo（硫酸新霉素）、NBT（氮蓝四唑）。
1.1.4 主要仪器设备
28 ℃恒温培养箱、烘箱、分析天平、天平、小型种子打碎机、摇床、超声波清洗仪、无菌超净台、高压蒸汽灭菌锅、恒温水浴锅、722 可见分光光度计、酶标仪、激光共聚焦显微镜、 PCR 仪等。
1．2 实验方法
1.2.1 菌种平板活化
将斜面培养基保存的母种接种至平板PDA固体培养基上，置于28 ℃恒温培养至菌丝长满平板。
1.2.2 生长实验
1.2.2.1 将PDA平板活化的菌种用打孔器（Ф=6 mm）打孔，并分别转接到CYM固体培养基中（接种块尽可能靠近正中心），实验设置三个重复；
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 实验材料 2
1.1.1 供试菌株 2
1.1.2 培养基 2
1.1.3 主要试剂与溶液 2
1.1.4 主要仪器设备 2
1.2 实验方法 3
1.2.1菌种平板活化 3
1.2.2生长实验 3
1.2.3液体发酵种子制备 3
1.2.4液体发酵 3
1.2.5生物量统计和三萜测定 3
2 结果与分析 3
2.1 灵芝生长实验结果与分析 3
2.2 灵芝生物量测定的结果与分析 5
2.3 灵芝菌丝内三萜含量测定的结果与分析 6
3 讨论 7
3.1 PLC基因对灵芝菌丝生长的影响 7
3.2 PLC基因对灵芝三萜合成的影响 7
致谢 7
参考文献 7
磷脂酶C对灵芝菌丝生长和次生代谢的影响
生物学基地班 韩贤舟
引言
引言
灵芝（Ganoderma lucidum）为大型高等担子菌，在分类学上属于真菌界、真核真菌亚界、真菌门、担子菌亚门、层菌纲、非褶菌目、灵芝菌科、灵芝属（Ganoderma）。人们通过实践和理论充分的肯定了灵芝的药用
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
价值，现代科学研究发现灵芝次生代谢产物灵芝三萜是其重要的药用成分。
灵芝三萜的生物合成途径被称为甲羟戊酸（MVA）代谢途径，此代谢途径主要在细胞质中，故又名细胞质代谢途径。MVA代谢途径首先是乙酰辅酶A经硫解酶催化缩合形成乙酰乙酰辅酶A，在3羟基3甲基戊二酸单酰辅酶A（HMGCoA）合成酶催化作用下，两分子的乙酰乙酰辅酶A缩合生成HMGCoA。生成的HMGCoA由 HMGCoA还原酶催化转变为甲羟戊酸。甲羟戊酸经甲羟戊酸 5磷酸激酶（PMK）和甲羟戊酸脱羧酶（MVD）以及甲羟戊酸激酶（MVK）等酶促反应转化为法呢酯焦磷酸。之后通过酶的缩合作用、氧化作用合成羊毛甾醇。最后通过细胞色素P450 还原酶（CYP51）将羊毛甾醇催化和侧链修饰合成不同结构的灵芝三萜类物质。
由于灵芝栽培生长期较长，受环境、霉菌和虫害影响大，这些因素严重影响了灵芝品质、产量的稳定性，同时也制约灵芝子实体生物活性物的推广应用。因此，更多的研究工作重点集中在如何提高灵芝菌丝体中的三萜含量。近年来，越来越多的研究者发现通过改变培养条件能够显著提高灵芝菌丝体中三萜的含量。随着对外界因子的探索，研究者发现多种环境因素也能够诱导灵芝三萜生物合成，其中包括一些如茉莉酸甲酯的植物信号分子物质。但目前，灵芝三萜生物合成的调控机理还知之甚少。
磷脂酶C，是一个在胞浆膜上的关键酶，完整名称为称磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C（PIPLC），催化PIP2分解产生1,4,5肌醇三磷酸和二酰甘油（DAG）两个信号分子。本实验将研究磷脂酶C对灵芝菌丝生长和次生代谢的影响。希望本实验可以为揭示灵芝有关次生代谢产物产生的分子机制和灵芝出菇的机理打下分子和理论基础。
细胞膜的重要构成组分之一磷脂酰肌醇，在磷脂酶的作用可以被水解，分解为三磷酸肌醇、磷脂酸、溶血磷脂、二酰基甘油、不饱和脂肪酸等。磷脂酰肌醇不仅可以作为磷脂的合成原料，并且在细胞感受外界刺激及其信号传导过程中也担任着重要的作用。磷脂酰肌醇信号传导途径与光合作用、激素调控等影响植物生长发育过程及抗逆信号传导关系密切，因为这些信号分子的产生直接受磷脂酶的活性的影响，所以磷脂酶在磷脂酰肌醇信号传导途径中是处在一个中心地位的。磷脂酶分类依照的是磷脂水解位点的不同，磷脂酶PLA2、PLC和PLD具有多种同功酶形式，它们分别在植物生长发育的不同阶段及对外界环境因子应答的信号传导过程中担任重要的调节作用。
在大型担子菌灵芝中PLC基因是否会影响灵芝的菌丝生长和次生代谢还不清楚，本研究通过沉默PLC基因的方法来研究PLC在灵芝中的作用与影响。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1.1.1 供试菌株
G20：灵芝野生型菌株（实验室保存）；
CK1、CK2：转入ura3沉默质粒的转化子；
PLC基因沉默菌株：PLCi7、PLCi14、PLCi19。
1.1.2 培养基
PDA培养基（1 L）：葡萄糖 20 g，去皮的马铃薯 200 g，水1000 mL。将马铃薯削去皮，切碎成适当大小的小块，在锅中加入8001000 mL的水，煮沸30分钟，用双层纱布进行过滤，保留滤液，加入糖，最后加水补到1000 mL，pH自然即可。固体培养基则加入20 g琼脂。
CYM培养基（1 L）：1% 麦芽糖，2% 葡萄糖，0.2% Yeast Extract（酵母提取物），0.2% peptone（蛋白胨），0.05% MgSO47H2O，0.46% K2HPO4；若配置固体培养基，则再加入2% Agar（琼脂）。
1.1.3 主要试剂
乙酸、盐酸、高氯酸、95%乙醇、无水乙醇、齐墩果酸、Neo（硫酸新霉素）、NBT（氮蓝四唑）。
1.1.4 主要仪器设备
28 ℃恒温培养箱、烘箱、分析天平、天平、小型种子打碎机、摇床、超声波清洗仪、无菌超净台、高压蒸汽灭菌锅、恒温水浴锅、722 可见分光光度计、酶标仪、激光共聚焦显微镜、 PCR 仪等。
1．2 实验方法
1.2.1 菌种平板活化
将斜面培养基保存的母种接种至平板PDA固体培养基上，置于28 ℃恒温培养至菌丝长满平板。
1.2.2 生长实验
1.2.2.1 将PDA平板活化的菌种用打孔器（Ф=6 mm）打孔，并分别转接到CYM固体培养基中（接种块尽可能靠近正中心），实验设置三个重复；
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