水稻中植物特有型RAB5蛋白的基因克隆及亚细胞定位研究
水稻中植物特有型RAB5蛋白的基因克隆及亚细胞定位研究[20200614172126]
摘要：在囊泡运输过程中，RAB5家族成员作为分子开关，调节了胞吞及分泌运输途径。在高等植物中存在一类植物特有型的RAB5蛋白，拟南芥中的植物特有型RAB5蛋白ARA6在储藏蛋白向液泡的运输中起重要作用，并且过表达组成型激活态ARA6可以提高植株对盐胁迫的耐性。为了解析水稻中植物特有型RAB5的功能，我们克隆了水稻中与拟南芥ARA6高度同源的RAB5基因-OsRab5b/5d，并根据对其进行了点突变，得到了能分别与GTP及GDP稳定结合的组成性激活态及负显性态编码基因。进一步，我们构建了OsRab5b/5d及其突变态与GFP融合蛋白的瞬时表达及双元载体，为解析OsRab5b/5d的亚细胞定位情况及其功能奠定了基础。
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关键字:水稻；Rab5蛋白；基因克隆
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 3
1.1 OsRAB5b/5d基因的克隆 3
1.1.1水稻叶片RNA的提取及第一链cDNA的合成 3
1.1.2引物设计 4
1.1.3 PCR扩增 4
1.1.4 PCR方法获得突变体OsRab5b/5d（CA）和OsRab5b/5d（DN） 5
1.2 OsRAB5b/5d-GFP载体构建 6
1.2.1大肠杆菌（DH5α）感受态的制备 6
1.2.2 35S：：OsRAB5b/5d：：GFP载体构建 6
1.3水稻OsRAB5b/5d基因的亚细胞定位 7
1.3.1烟草瞬时表达系统建立 7
1.3.2 GFP观察 8
2 结果与分析 9
2.1水稻叶片RNA的提取与目的基因的扩增 9
2.2 35S：：GFP：：OsRAB5b/5d载体构建 9
2.3 35S：：GFP：：OsRAB5b载体的转化验证 13
3 讨论 14
致谢 14
参考文献： 14
水稻中植物特有型RAB5蛋白的基因克隆及亚细胞定位研究
引言
细胞中内膜系统的蛋白和膜物质在合成之后须经过囊泡（Vesicle）运输才能到达其发挥作用的地方。囊泡运输为植物正常生长、发育，以及维持细胞稳态（homeostasis）所必需。例如，囊泡运输维持细胞内生长素外运蛋白PINs的极性定位，产生对植物生存至关重要的液泡，参与胞质分离， *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
以及响应生物及非生物逆境胁迫（Surpin and Raikhel，2004；Grefen et al,2007）。
囊泡在两个膜室之间运输要经历囊泡从供体膜出芽、沿细胞骨架运动、在靶膜上停泊/拴系及SNARE蛋白介导的囊泡与靶膜的融合。囊泡在两个膜室之间运输的每一步在时间、空间上都需要紧密调控。RAB是小G蛋白家族中最大的一个亚家族，定位在不同的细胞器上，参与到上述所有步骤的调节（Zerial and McBride 2001；Woollard and Moore,2008）。Rab小G蛋白在Rab-GTP激活态和与Rab-GDP失活态之间循环。Rab-GTP能与其效应因子发生互作，进而调控下游事件。其GTP与GDP结合态之间的循环依赖于其他蛋白的调节。例如，鸟嘌呤交换因子（guanine nucleotide exchange factor，GEF）能够诱导产生Rab-GTP；G蛋白激活蛋白（GTPase-activating protein，GAP）能够促进水解GTP，使小G蛋白重新回到GDP结合的失活态（Takai et al.，2001）。
拟南芥中含有三个RAB5同源基因，RHA1和ARA7属于传统型，与人类的RAB5C具有较高的同源性，ARA6则为植物所特有的RAB5蛋白（Ueda et al., 2001）。RHA1和ARA7具有C端半胱氨酸基序，能被异戊二烯化(isoprenylation)而和膜结合并发挥作用。ARA6缺少此基序以及一个高度变化的区域（hypervariable region），但在N端具有脂酰化位点使其可以被脂酰化后锚定在膜上（Ueda et al., 2001）。过表达ARA7负显性基因的突变体（dominant negative mutant）或Rab5 GEF vps9a RNAi株系中PIN1和PIN2蛋白无法内吞形成其特有的极性分布，使得生长素分布紊乱，拟南芥形态建成异常（Dhonukshe et al, 2008）。RHA1和ARA7定位在液泡前体膜上，在原生质体和烟草表皮细胞中调控靶向液泡的蛋白运输（Sohn et al., 2003; Kotzer et al., 2004）。ARA6和Rha1/Ara7分布在不同类型的内体中（Ueda et al., 2001；Geldner et al., 2003；Ueda et al., 2004），并且和Rha1/ARA7有着不同的功能。SNARE复合体VAPM727/SYP22/VTI11/SYP51作用于液泡前体之间以及液泡前体与液泡之间的膜融合，在储藏蛋白向储藏液泡的运输过程中起作用（Ebine et al.,2008），rha1/syp22-1双突变体呈现12S球蛋白积累的表型，暗示在这一过程中Rha1调节含有SYP22的SNARE复合体的形成。ARA6特异性地调控含VAMP727/SYP121的SNARE复合体的形成，介导从内体到质膜的运输，超表达ARA6Q93L使植物抗盐（Ebine et al., 2011）。这些结果证明了两种类型的RAB5结合不同SNARE复合体，在储藏蛋白靶向液泡的运输或抵抗盐胁迫中发挥功能。
水稻中存在57个RAB蛋白，蛋白质序列聚类分析结果显示，与OsRAB5a（Os12g43550）聚类到同一分支下的还有四个RAB蛋白。经氨基酸序列比对发现，Os03g46390与OsRAB5a（ *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
Os12g43550）具有很高的同源性，属于传统型的RAB5蛋白（与人类的RAB5c具有相似的结构）；而Os03g05740、Os10g30520与拟南芥中的ARA6具有较高的同源性，属于植物特有型的RAB5蛋白。
我们将与RAB5a同源性较高的Os03g46390命名为RAB5c，其显著的特征是在C端具有异戊二烯化位点，可以通过脂酰化修饰后锚定在膜上；将 Os03g05740、Os10g30520分别命名为RAB5b和RAB5d，它们属于植物中特有型的RAB5成员，和拟南芥中报道的ARA6具有相似的结构，其C端的缺少异戊二烯化位点，而在N端具有棕榈酸化和豆蔻酰化位点，可以通过脂酰化而锚定在膜上。此外，传统型RAB5与植物中特有型的RAB5 具有不同的效应子结构域，暗示了它们可能作用于不同的下游蛋白，进而调控不同的细胞生物学过程。这一点已在拟南芥中RAB5研究中得到了证实。值得注意的是拟南芥和水稻中传统型的RAB5都参与储藏蛋白的运输，这说明拟南芥和水稻中的RAB5可能功能保守。拟南芥中植物特有型的ARA6参与植物抗盐（Ebine et al., 2011），促使我们对水稻特有型的OsRAB5b和OsRAB5d进行克隆并进行功能研究。
1 材料与方法
1.1 OsRAB5b/5d基因的克隆
1.1.1水稻叶片RNA的提取及第一链cDNA的合成
取生长两周的水稻幼苗叶片（日本晴，Nipponbare），采用Trizol法提取叶片组织RNA，具体步骤如下：
1. 研钵中加液氮预冷，取水稻叶片于液氮中冷冻研磨至粉末状；
2. 每100mg组织加1mL Trizol，颠倒混匀，室温放置5min；
3. 加入1/5V氯仿（0.2mL）剧烈振荡15s，室温放置2—5min；
4. 4℃，12000g离心15min，RNA已全部溶解于上层水相，转移上层水相（约400μl）于另一1.5mL EP管中；
5. 加等体积异丙醇，混匀，室温放置10min，沉淀RNA；
摘要：在囊泡运输过程中，RAB5家族成员作为分子开关，调节了胞吞及分泌运输途径。在高等植物中存在一类植物特有型的RAB5蛋白，拟南芥中的植物特有型RAB5蛋白ARA6在储藏蛋白向液泡的运输中起重要作用，并且过表达组成型激活态ARA6可以提高植株对盐胁迫的耐性。为了解析水稻中植物特有型RAB5的功能，我们克隆了水稻中与拟南芥ARA6高度同源的RAB5基因-OsRab5b/5d，并根据对其进行了点突变，得到了能分别与GTP及GDP稳定结合的组成性激活态及负显性态编码基因。进一步，我们构建了OsRab5b/5d及其突变态与GFP融合蛋白的瞬时表达及双元载体，为解析OsRab5b/5d的亚细胞定位情况及其功能奠定了基础。
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关键字:水稻；Rab5蛋白；基因克隆
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 3
1.1 OsRAB5b/5d基因的克隆 3
1.1.1水稻叶片RNA的提取及第一链cDNA的合成 3
1.1.2引物设计 4
1.1.3 PCR扩增 4
1.1.4 PCR方法获得突变体OsRab5b/5d（CA）和OsRab5b/5d（DN） 5
1.2 OsRAB5b/5d-GFP载体构建 6
1.2.1大肠杆菌（DH5α）感受态的制备 6
1.2.2 35S：：OsRAB5b/5d：：GFP载体构建 6
1.3水稻OsRAB5b/5d基因的亚细胞定位 7
1.3.1烟草瞬时表达系统建立 7
1.3.2 GFP观察 8
2 结果与分析 9
2.1水稻叶片RNA的提取与目的基因的扩增 9
2.2 35S：：GFP：：OsRAB5b/5d载体构建 9
2.3 35S：：GFP：：OsRAB5b载体的转化验证 13
3 讨论 14
致谢 14
参考文献： 14
水稻中植物特有型RAB5蛋白的基因克隆及亚细胞定位研究
引言
细胞中内膜系统的蛋白和膜物质在合成之后须经过囊泡（Vesicle）运输才能到达其发挥作用的地方。囊泡运输为植物正常生长、发育，以及维持细胞稳态（homeostasis）所必需。例如，囊泡运输维持细胞内生长素外运蛋白PINs的极性定位，产生对植物生存至关重要的液泡，参与胞质分离， *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
以及响应生物及非生物逆境胁迫（Surpin and Raikhel，2004；Grefen et al,2007）。
囊泡在两个膜室之间运输要经历囊泡从供体膜出芽、沿细胞骨架运动、在靶膜上停泊/拴系及SNARE蛋白介导的囊泡与靶膜的融合。囊泡在两个膜室之间运输的每一步在时间、空间上都需要紧密调控。RAB是小G蛋白家族中最大的一个亚家族，定位在不同的细胞器上，参与到上述所有步骤的调节（Zerial and McBride 2001；Woollard and Moore,2008）。Rab小G蛋白在Rab-GTP激活态和与Rab-GDP失活态之间循环。Rab-GTP能与其效应因子发生互作，进而调控下游事件。其GTP与GDP结合态之间的循环依赖于其他蛋白的调节。例如，鸟嘌呤交换因子（guanine nucleotide exchange factor，GEF）能够诱导产生Rab-GTP；G蛋白激活蛋白（GTPase-activating protein，GAP）能够促进水解GTP，使小G蛋白重新回到GDP结合的失活态（Takai et al.，2001）。
拟南芥中含有三个RAB5同源基因，RHA1和ARA7属于传统型，与人类的RAB5C具有较高的同源性，ARA6则为植物所特有的RAB5蛋白（Ueda et al., 2001）。RHA1和ARA7具有C端半胱氨酸基序，能被异戊二烯化(isoprenylation)而和膜结合并发挥作用。ARA6缺少此基序以及一个高度变化的区域（hypervariable region），但在N端具有脂酰化位点使其可以被脂酰化后锚定在膜上（Ueda et al., 2001）。过表达ARA7负显性基因的突变体（dominant negative mutant）或Rab5 GEF vps9a RNAi株系中PIN1和PIN2蛋白无法内吞形成其特有的极性分布，使得生长素分布紊乱，拟南芥形态建成异常（Dhonukshe et al, 2008）。RHA1和ARA7定位在液泡前体膜上，在原生质体和烟草表皮细胞中调控靶向液泡的蛋白运输（Sohn et al., 2003; Kotzer et al., 2004）。ARA6和Rha1/Ara7分布在不同类型的内体中（Ueda et al., 2001；Geldner et al., 2003；Ueda et al., 2004），并且和Rha1/ARA7有着不同的功能。SNARE复合体VAPM727/SYP22/VTI11/SYP51作用于液泡前体之间以及液泡前体与液泡之间的膜融合，在储藏蛋白向储藏液泡的运输过程中起作用（Ebine et al.,2008），rha1/syp22-1双突变体呈现12S球蛋白积累的表型，暗示在这一过程中Rha1调节含有SYP22的SNARE复合体的形成。ARA6特异性地调控含VAMP727/SYP121的SNARE复合体的形成，介导从内体到质膜的运输，超表达ARA6Q93L使植物抗盐（Ebine et al., 2011）。这些结果证明了两种类型的RAB5结合不同SNARE复合体，在储藏蛋白靶向液泡的运输或抵抗盐胁迫中发挥功能。
水稻中存在57个RAB蛋白，蛋白质序列聚类分析结果显示，与OsRAB5a（Os12g43550）聚类到同一分支下的还有四个RAB蛋白。经氨基酸序列比对发现，Os03g46390与OsRAB5a（ *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
Os12g43550）具有很高的同源性，属于传统型的RAB5蛋白（与人类的RAB5c具有相似的结构）；而Os03g05740、Os10g30520与拟南芥中的ARA6具有较高的同源性，属于植物特有型的RAB5蛋白。
我们将与RAB5a同源性较高的Os03g46390命名为RAB5c，其显著的特征是在C端具有异戊二烯化位点，可以通过脂酰化修饰后锚定在膜上；将 Os03g05740、Os10g30520分别命名为RAB5b和RAB5d，它们属于植物中特有型的RAB5成员，和拟南芥中报道的ARA6具有相似的结构，其C端的缺少异戊二烯化位点，而在N端具有棕榈酸化和豆蔻酰化位点，可以通过脂酰化而锚定在膜上。此外，传统型RAB5与植物中特有型的RAB5 具有不同的效应子结构域，暗示了它们可能作用于不同的下游蛋白，进而调控不同的细胞生物学过程。这一点已在拟南芥中RAB5研究中得到了证实。值得注意的是拟南芥和水稻中传统型的RAB5都参与储藏蛋白的运输，这说明拟南芥和水稻中的RAB5可能功能保守。拟南芥中植物特有型的ARA6参与植物抗盐（Ebine et al., 2011），促使我们对水稻特有型的OsRAB5b和OsRAB5d进行克隆并进行功能研究。
1 材料与方法
1.1 OsRAB5b/5d基因的克隆
1.1.1水稻叶片RNA的提取及第一链cDNA的合成
取生长两周的水稻幼苗叶片（日本晴，Nipponbare），采用Trizol法提取叶片组织RNA，具体步骤如下：
1. 研钵中加液氮预冷，取水稻叶片于液氮中冷冻研磨至粉末状；
2. 每100mg组织加1mL Trizol，颠倒混匀，室温放置5min；
3. 加入1/5V氯仿（0.2mL）剧烈振荡15s，室温放置2—5min；
4. 4℃，12000g离心15min，RNA已全部溶解于上层水相，转移上层水相（约400μl）于另一1.5mL EP管中；
5. 加等体积异丙醇，混匀，室温放置10min，沉淀RNA；
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