水稻田中嗜甲烷菌的分离和筛选水稻田中嗜甲烷菌的分离和筛选【字数：7684】
甲烷是天然气、沼气、油田气及煤矿坑道气的主要成分，是世界上的第二大温室效应气体（近150年来，大气中的甲烷气体的含量不断的增长，对全球变暖的贡献量为18%）。因此，甲烷的开采、生成、转化和排放关系着能源、化工和环境等一系列重要问题，是全球关注的热点。甲烷的生成和氧化是自然界碳素循环的重要环节。一些微生物利用CO2生成CH4，而另一些则能将CH4转化为生物量和CO2。甲烷氧化过程主要由嗜甲烷细菌（Methanotrophic Bacteria）完成，环境中的甲烷在厌氧的生境中由产甲烷细菌形成后，经过土壤层和水层，逸散进入大气层，在途经水层和土壤层的时候可以被栖息于其间的甲烷氧化菌氧化，土壤中甲烷氧化菌氧化作用，大约占大气甲烷消耗量的10%。本研究主要着眼于水稻田中的甲烷氧化菌，水稻是大气甲烷的重要生物源之一，每年大概有有60Tg及以上的甲烷气体从水稻田排放到大气中，大约占全球总排放量的12%。因此，控制和减少水稻田中的土壤内产生甲烷气体的数量，也即在控制和减少稻田土壤甲烷形成量的同时，加强和促进土壤中的甲烷氧化速率，对降低温室效应的贡献是极其重要的。在目前尚无更好的措施减少甲烷形成量的前提下，进行了以下研究:本研究目的之一旨在从水稻土壤中选育出甲烷氧化菌的优势菌株，以这个作为研究起点，为以后的相关研究准备好良好的样本。
目录
摘要3
关键词3
Abstract 3
Key words 3
引言5
1材料与方法5
1.1实验材料 5
1.2实验方法 5
1.2.1 取样5
1.2.2 制备样品土壤稀释液5
1.2.3 初样的富集5
1.2.4 浓度梯度稀释涂布5
1.2.5 分离纯化5
1.2.6 16SrRNAPCR扩增和琼脂糖凝胶电泳 6
1.2.7 基因测序6
2 实验结果与分析 7
2.1 富集操作培养结果7
2.2浓度梯度稀释平板结果7
2.3第1、2次分离纯化结果8
2.4 凝胶电泳结果9
2.5基因测序和进化树9
3 讨论11
致 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
谢12
参考文献12
水稻田中嗜甲烷菌的分离和筛选
生命基地151班 张家鹏
引言
引言
甲烷是天然气以及沼气的主要成分、是世界上第二大温室气体。近年来，随着温室效应的不断增加，实验室对如何消除温室效应的研究也在不断增加。甲烷氧化菌能以甲烷为唯一碳源和能源生长，在能源、化工和环境等方面被寄予厚望。但是，由于受天然气价格、研究材料和研究方法等因素的影响，国际上对嗜甲烷菌的研究难以持续，目前还处于初级阶段，国外正式研究甲烷氧化菌的实验室很少。反观我国的嗜甲烷菌的研究，则更几乎处于空白阶段，基本上可以说，我国的甲烷氧化菌的研究还处于起步阶段，亟待提高。
近年来，随着石油价格攀升、天然气产量增加，嗜甲烷菌的研究逐渐升温。例如，甲烷氧化酶pMMO，其负责甲烷到甲醇的催化，是整个甲烷转化过程中最重要的酶，其表达受到铜离子浓度的控制。但由于材料和方法等因素限制，其调控的分子机制几乎处于空白，限制了嗜甲烷菌的理论研究和生产应用，亟待解决。甲烷氧化菌还有许多有价值的研究，同时，甲烷还是是天然气、沼气、油田气及煤矿坑道气的主要成分，是第二大温室气体（近150多年来，大气中的甲烷含量急剧不断增长，大概对全球变暖的贡献量在18%左右）[1,2]。因此，甲烷的开采、生成、转化和排放关系着能源、化工和环境等一系列重要问题，是全球关注的热点。甲烷氧化过程主要由甲烷氧化菌完成，环境中的甲烷气体在厌氧的生物环境当中由产甲烷细菌形成之后，会经过土壤层和水层，最终挥发进入到大气层之中，在途经水层和土壤层的时候可以被栖息于其间的甲烷氧化菌氧化，土壤中甲烷氧化菌氧化作用，大约占大气甲烷消耗量的10% [3,4]。
国际能源价格波动直接影响甲烷氧化菌的受关注度，当天然气价格下降，石油价格上升时，关于甲烷氧化菌的研究就会相应变热，反之相关研究则急剧减少。近些年来，随着天然气价格下降，甲烷氧化菌的研究又逐渐升温。究其原因，甲烷虽然是一种清洁能源，但甲烷的利用率却很低，因为甲烷的运输会损耗很多。比如，石油伴生的天然气、瓦斯、和低浓度状态的天然气都因为难以应用而被烧掉或放掉（收集和运输的成本过高），据统计美国每年简单烧掉的甲烷约占其年交通能耗的28%，我国的这一相关数据也差不多是这个数字。这种简单的燃烧或排放不仅是能源的巨大浪费，更加剧全球的温室效应[5,6]。为了解决这一问题，人们将目光聚集到了甲烷氧化菌上，希望利用甲烷氧化菌将这些甲烷转化为有价值的化合物并减少碳排放[7,8]。目前开展甲烷氧化菌研究的实验室很少，主要来自欧洲（如俄罗斯国家科学院的Yu. A. Trotsenko）和美国（如华盛顿大学的Mary E. Lidstrom，http://depts.washington.edu/mllab/），这和他们的巨大的天然气储量和利用率有直接关系。反观国内，由于天然气储量较低和研究水平滞后等因素，导致关于甲烷氧化菌的研究鲜有受到关注，而且受经济方面等因素的影响，能够坚持长期从事甲烷氧化菌研究的实验室很少，加之该类菌分离培养困难和遗传操作缺乏，导致甲烷氧化菌基础研究进展缓慢，这也限制了它们的生产应用[11]。
甲烷氧化菌在众多的微生物中空气净化的佼佼者。它们既能吸收环境中主要的温室气体，也能吸收环境中的重金属。如环境中的铜离子，因此甲烷氧化菌的实际应用还能和医学相关，由于甲烷氧化菌素会与铜紧密地结合，威尔逊病是一种罕见的人类遗传性疾病，他的主要致病机理是使患者的身体无法正确处理摄入身体中的铜离子，而我们人体通过进食和其他行为必然会摄入铜离子，由此会导致人体内铜离子的增加。目前已知的是，该病会导致患者体内的各脏器比如大脑豆状核，以及人体内的肝脏，人体内的肾脏和人体的角膜中大量沉着铜离子，从而使人致病。目前的研究已经表明，威尔逊病是一种属于常染色体隐形遗传病，由于是常隐病，其治疗方法亟待解决，而且由于铜离子在以上说的各种脏器内沉积的数量以及时间的不同，威尔逊病会在临床上出现各种不同的表现，比如震颤、扭转痉挛、精神障碍、肝脾肿大、腹水等。因此该病亟需解决，而因为甲烷氧化菌有吸附铜离子的作用，因此目前考虑用甲烷氧化菌制作成的新的种类的人类益生菌可能是解决该病的一种可行的思路。
总之，甲烷氧化菌的作用十分巨大，比如在减少温室效应方面和医疗相关领域，而且甲烷氧化菌的研究潜力很大，但是这个领域在现在是一个冷门领域，国外的相关实验室很少，而我们国内基本上对这个研究处于空白，为充分发挥甲烷氧化菌微生物在吸收利用甲烷、缓解温室效应、循环经济的价值，并且为了减少全球碳排放，弥补我国在甲烷氧化菌这一方面的空白，开展了关于甲烷氧化菌的基础研究，即首先要从我国本土的水稻田中分离出甲烷氧化菌，并对其进行种属鉴定，确定是否能得到新的菌种。以期能为甲烷氧化菌领域奉献一份自己的力量。
目录
摘要3
关键词3
Abstract 3
Key words 3
引言5
1材料与方法5
1.1实验材料 5
1.2实验方法 5
1.2.1 取样5
1.2.2 制备样品土壤稀释液5
1.2.3 初样的富集5
1.2.4 浓度梯度稀释涂布5
1.2.5 分离纯化5
1.2.6 16SrRNAPCR扩增和琼脂糖凝胶电泳 6
1.2.7 基因测序6
2 实验结果与分析 7
2.1 富集操作培养结果7
2.2浓度梯度稀释平板结果7
2.3第1、2次分离纯化结果8
2.4 凝胶电泳结果9
2.5基因测序和进化树9
3 讨论11
致 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
谢12
参考文献12
水稻田中嗜甲烷菌的分离和筛选
生命基地151班 张家鹏
引言
引言
甲烷是天然气以及沼气的主要成分、是世界上第二大温室气体。近年来，随着温室效应的不断增加，实验室对如何消除温室效应的研究也在不断增加。甲烷氧化菌能以甲烷为唯一碳源和能源生长，在能源、化工和环境等方面被寄予厚望。但是，由于受天然气价格、研究材料和研究方法等因素的影响，国际上对嗜甲烷菌的研究难以持续，目前还处于初级阶段，国外正式研究甲烷氧化菌的实验室很少。反观我国的嗜甲烷菌的研究，则更几乎处于空白阶段，基本上可以说，我国的甲烷氧化菌的研究还处于起步阶段，亟待提高。
近年来，随着石油价格攀升、天然气产量增加，嗜甲烷菌的研究逐渐升温。例如，甲烷氧化酶pMMO，其负责甲烷到甲醇的催化，是整个甲烷转化过程中最重要的酶，其表达受到铜离子浓度的控制。但由于材料和方法等因素限制，其调控的分子机制几乎处于空白，限制了嗜甲烷菌的理论研究和生产应用，亟待解决。甲烷氧化菌还有许多有价值的研究，同时，甲烷还是是天然气、沼气、油田气及煤矿坑道气的主要成分，是第二大温室气体（近150多年来，大气中的甲烷含量急剧不断增长，大概对全球变暖的贡献量在18%左右）[1,2]。因此，甲烷的开采、生成、转化和排放关系着能源、化工和环境等一系列重要问题，是全球关注的热点。甲烷氧化过程主要由甲烷氧化菌完成，环境中的甲烷气体在厌氧的生物环境当中由产甲烷细菌形成之后，会经过土壤层和水层，最终挥发进入到大气层之中，在途经水层和土壤层的时候可以被栖息于其间的甲烷氧化菌氧化，土壤中甲烷氧化菌氧化作用，大约占大气甲烷消耗量的10% [3,4]。
国际能源价格波动直接影响甲烷氧化菌的受关注度，当天然气价格下降，石油价格上升时，关于甲烷氧化菌的研究就会相应变热，反之相关研究则急剧减少。近些年来，随着天然气价格下降，甲烷氧化菌的研究又逐渐升温。究其原因，甲烷虽然是一种清洁能源，但甲烷的利用率却很低，因为甲烷的运输会损耗很多。比如，石油伴生的天然气、瓦斯、和低浓度状态的天然气都因为难以应用而被烧掉或放掉（收集和运输的成本过高），据统计美国每年简单烧掉的甲烷约占其年交通能耗的28%，我国的这一相关数据也差不多是这个数字。这种简单的燃烧或排放不仅是能源的巨大浪费，更加剧全球的温室效应[5,6]。为了解决这一问题，人们将目光聚集到了甲烷氧化菌上，希望利用甲烷氧化菌将这些甲烷转化为有价值的化合物并减少碳排放[7,8]。目前开展甲烷氧化菌研究的实验室很少，主要来自欧洲（如俄罗斯国家科学院的Yu. A. Trotsenko）和美国（如华盛顿大学的Mary E. Lidstrom，http://depts.washington.edu/mllab/），这和他们的巨大的天然气储量和利用率有直接关系。反观国内，由于天然气储量较低和研究水平滞后等因素，导致关于甲烷氧化菌的研究鲜有受到关注，而且受经济方面等因素的影响，能够坚持长期从事甲烷氧化菌研究的实验室很少，加之该类菌分离培养困难和遗传操作缺乏，导致甲烷氧化菌基础研究进展缓慢，这也限制了它们的生产应用[11]。
甲烷氧化菌在众多的微生物中空气净化的佼佼者。它们既能吸收环境中主要的温室气体，也能吸收环境中的重金属。如环境中的铜离子，因此甲烷氧化菌的实际应用还能和医学相关，由于甲烷氧化菌素会与铜紧密地结合，威尔逊病是一种罕见的人类遗传性疾病，他的主要致病机理是使患者的身体无法正确处理摄入身体中的铜离子，而我们人体通过进食和其他行为必然会摄入铜离子，由此会导致人体内铜离子的增加。目前已知的是，该病会导致患者体内的各脏器比如大脑豆状核，以及人体内的肝脏，人体内的肾脏和人体的角膜中大量沉着铜离子，从而使人致病。目前的研究已经表明，威尔逊病是一种属于常染色体隐形遗传病，由于是常隐病，其治疗方法亟待解决，而且由于铜离子在以上说的各种脏器内沉积的数量以及时间的不同，威尔逊病会在临床上出现各种不同的表现，比如震颤、扭转痉挛、精神障碍、肝脾肿大、腹水等。因此该病亟需解决，而因为甲烷氧化菌有吸附铜离子的作用，因此目前考虑用甲烷氧化菌制作成的新的种类的人类益生菌可能是解决该病的一种可行的思路。
总之，甲烷氧化菌的作用十分巨大，比如在减少温室效应方面和医疗相关领域，而且甲烷氧化菌的研究潜力很大，但是这个领域在现在是一个冷门领域，国外的相关实验室很少，而我们国内基本上对这个研究处于空白，为充分发挥甲烷氧化菌微生物在吸收利用甲烷、缓解温室效应、循环经济的价值，并且为了减少全球碳排放，弥补我国在甲烷氧化菌这一方面的空白，开展了关于甲烷氧化菌的基础研究，即首先要从我国本土的水稻田中分离出甲烷氧化菌，并对其进行种属鉴定，确定是否能得到新的菌种。以期能为甲烷氧化菌领域奉献一份自己的力量。
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