植物特有的rab5同源基因在水稻抗盐中的机理研究
土壤盐渍化会影响作物质量和产量，并会限制农业发展。本文立足于已有的研究报道，利用转基因技术结合激光共聚焦显微镜观察，初步研究了参与囊泡运输的RAB5小G蛋白与水稻抗盐机制之间存在的联系。结果表明，RAB5b作为囊泡运输过程中的调节因子，在盐胁迫下，其组成型激活态的过表达可以维持Na+/H+反向转运子（NHX1）定位于液泡膜上；而NHX1可以将存在于细胞质内的高浓度Na+泵入液泡内存储起来，即区室化，从而增强植株的耐盐性、减少了高浓度盐离子对细胞器和酶类的伤害。本文为通过遗传手段培育耐盐作物提供了新的思路及理论依据。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引 言 1
1 材料与方法 3
1.1 植物材料 3
1.2 试剂及各种化学药品 3
1.3 实验仪器 3
1.4 方法 3
1.4.1 拟南芥室内培养 3
1.4.2 拟南芥盐处理 3
1.4.3 Na+/Ca2+染色方法（用于激光共聚焦显微镜观察） 4
1.4.4 农杆菌的转化 4
1.4.5 农杆菌介导的拟南芥转化 4
1.4.6 拟南芥杂交及后代筛选方法 4
2 结果与分析 4
2.1 RAB5bCA过表达增强了Na+的区室化 5
2.1.1 RAB5bCA过表达对植株表型的影响 5
2.1.2 RAB5bCA过表达对植株体内Na+分布的影响 5
2.1.3 RAB5bCA过表达对植株中Ca2+分布的影响 6
2.2 RAB5bCA过表达对NHX1蛋白质亚细胞定位的影响 7
2.2.1 在无盐胁迫情况下，RAB5bCA过表达对NHX1的运输无影响 7
2.2.2 盐胁迫下RAB5bCA过表达能够维持NHX1的正确膜定位 7
3 讨论 8
3.1 RAB5bCA通过囊泡运输过程调控植株耐盐性 8
3.2 本研究的意义及创新性 9
致谢 9
参考文献: 9
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物特有的RAB5同源基因在水稻抗盐中的机理研究
引言
土壤盐渍化是导致土地荒漠化和耕地退化的主要因素之一，也是自然界中主要的非生物胁迫之一，对农业生产和生态环境带来了巨大的负面影响。土壤盐渍化的形成受自然因素和人为因素的影响。常见的自然因素有气候、地貌、地质构造、土壤质地、土壤水分蒸腾损失等；人为因素包括灌溉水质差、灌溉方式不合理、土地管理不足等。近年来土壤盐碱化的问题越发严重[1]。
高浓度的盐离子会引起盐胁迫，扰乱植物体内的离子和水势平衡、引起毒害，导致植物停止生长、最终导致植物死亡，作物减产[2]。盐胁迫对植物的损伤主要体现在三个方面：离子胁迫、渗透胁迫以及氧化胁迫。其中离子胁迫是大量的Na+与K+竞争、并取代植物生长所必须的K+；而K+是植物体内多种酶发挥活性所必需的，使植物体内蛋白质合成的必要成分。同时植物体内过量积累Na+还会妨碍其对其他营养成分的吸收，破坏营养平衡。离子毒害会抑制细胞内酶的活性以及蛋白质的合成，干扰正常的代谢过程，从而造成植物的生理生化紊乱。而渗透胁迫主要表现为高浓度的Na+引起土壤水势下降，导致植物根系几乎无法吸收水分；同时根系吸收的Na+随水分蒸腾到达植物地上部，会在叶中积累，导致叶片产生坏死斑、并会缩短叶片寿命、影响光合作用、降低产量。盐胁迫导致的营养失衡、代谢以及渗透胁迫会进一步导致氧化胁迫，使光合作用及呼吸作用的电子链断裂，从而导致植株死亡。因此，植物对盐胁迫的适应性分子机制也主要表现为降低离子毒害、调控其体内的渗透平衡[2]。
正如盐对植物有多方面的影响，植物也有许多机制来抗盐。这些机制可分为三个主要的类别：1.渗透调节：植物利用能够减少植物地上部分增长的远距离信号进行调节，并且在地上部分积累Na+之前就启动[3]；2.离子调节：通过调节Na+和Cl在根部的转运过程减少它们两者在叶片中的积累[4]；3.组织调节：在这个过程中，植物内盐离子含量虽然很高，但是在细胞间和细胞内（特别是在液泡中）可被区室化，从而降低细胞中的盐浓度，减缓盐胁迫[5]。
植物对于盐胁迫的调节是非常复杂的，多种基因均参与其中。因此，对耐盐机制特性的研究是很有价值的[6]。而植物囊泡运输是这些机制发挥作用的重要步骤之一；囊泡运输和植物耐盐性之间的关系近年来也被众多研究所发现。
囊泡运输是不同细胞器之间传递物质的基本方式，分为4个重要步骤：囊泡的出芽、转运、拴系和融合。运输囊泡与受体膜之间的最初接触是由RAB GTPase和拴系因子介导的，拴系因子促使囊泡与受体膜靠近，使囊泡上的vSNARE与靶膜上的tSNARE形成四螺旋的SNARE复合体，从而导致磷脂双分子层的融合。拴系因子能够与SNARE、RAB等相互作用调控囊泡运输[7]。
RABs属于小GTP酶的亚家族,它能调节囊泡运输的多个步骤，包括囊泡出芽和将囊泡拴系到靶细胞膜上的过程[8]。同时，RABs也在通过招募马达蛋白来使囊泡运输和转运囊泡方面也起到了重要的作用。RABs在与GDP结合时的失活态和与GTP结合时的激活态之间循环，充当囊泡运输的分子开关[9]。
运输小泡被拴系在靶膜上之后，进入膜融合反应，这个过程由SNARE蛋白执行。 SNAREs是存在于所有真核生物中的蛋白质家族，其通过跨膜结构域或脂肪酰化锚定在囊泡或者靶膜上组装成一个紧密、稳定的复合物称为SNARE复合物[10]。组装成的SANRE复合物将运输小泡的膜双分子层和靶膜拉到足够近，让两个膜进行融合。四个SNARE蛋白质的特定结合，同时伴随由一个特定的RAB GTP酶调节的不同拴系复合物，赋予了膜融合的特异性[11]。
囊泡运输在植物适应胁迫方面具有重要作用。研究显示，小G蛋白ARA6能特异性地调控含VAMP727/SYP121的SNARE复合体的形成，介导从内体到质膜的运输；并且超表达ARA6Q93L使植物具有抗盐特性[12]。这些结果证明RAB5结合不同SNARE复合体，在储藏蛋白靶向液泡的运输或抵抗盐胁迫中发挥功能。植物拥有独特的囊泡运输网络，能够在特定的SNARE复合物和特定的RAB之间建立联系。
拟南芥中含有三个RAB5同源蛋白，RHA1和ARA7属于传统型，与人类RAB5C具有较高的同源性；ARA6则为植物所特有的RAB5蛋白[1315]。拟南芥中植物特有型的ARA6参与植物抗盐；水稻中含有两个与ARA6同源的植物特有型RAB蛋白（分别命名为RAB5b和RAB5d），在植物耐盐过程中的作用尚没有被完全阐明[16]。虽然人们对水稻抗盐进行了积极的研究，但水稻的抗盐机制还远未被解析，例如囊泡运输和水稻抗盐性之间的关系几乎是一个研究空白。为了给水稻遗传改良提供更好的信息，本文欲对水稻中植物特有型RAB5蛋白（OsRAB5b、OsRAB5d）是否参与耐盐途径，以及植物特有型RAB5介导耐盐途径的可能机制进行探究。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引 言 1
1 材料与方法 3
1.1 植物材料 3
1.2 试剂及各种化学药品 3
1.3 实验仪器 3
1.4 方法 3
1.4.1 拟南芥室内培养 3
1.4.2 拟南芥盐处理 3
1.4.3 Na+/Ca2+染色方法（用于激光共聚焦显微镜观察） 4
1.4.4 农杆菌的转化 4
1.4.5 农杆菌介导的拟南芥转化 4
1.4.6 拟南芥杂交及后代筛选方法 4
2 结果与分析 4
2.1 RAB5bCA过表达增强了Na+的区室化 5
2.1.1 RAB5bCA过表达对植株表型的影响 5
2.1.2 RAB5bCA过表达对植株体内Na+分布的影响 5
2.1.3 RAB5bCA过表达对植株中Ca2+分布的影响 6
2.2 RAB5bCA过表达对NHX1蛋白质亚细胞定位的影响 7
2.2.1 在无盐胁迫情况下，RAB5bCA过表达对NHX1的运输无影响 7
2.2.2 盐胁迫下RAB5bCA过表达能够维持NHX1的正确膜定位 7
3 讨论 8
3.1 RAB5bCA通过囊泡运输过程调控植株耐盐性 8
3.2 本研究的意义及创新性 9
致谢 9
参考文献: 9
植 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
物特有的RAB5同源基因在水稻抗盐中的机理研究
引言
土壤盐渍化是导致土地荒漠化和耕地退化的主要因素之一，也是自然界中主要的非生物胁迫之一，对农业生产和生态环境带来了巨大的负面影响。土壤盐渍化的形成受自然因素和人为因素的影响。常见的自然因素有气候、地貌、地质构造、土壤质地、土壤水分蒸腾损失等；人为因素包括灌溉水质差、灌溉方式不合理、土地管理不足等。近年来土壤盐碱化的问题越发严重[1]。
高浓度的盐离子会引起盐胁迫，扰乱植物体内的离子和水势平衡、引起毒害，导致植物停止生长、最终导致植物死亡，作物减产[2]。盐胁迫对植物的损伤主要体现在三个方面：离子胁迫、渗透胁迫以及氧化胁迫。其中离子胁迫是大量的Na+与K+竞争、并取代植物生长所必须的K+；而K+是植物体内多种酶发挥活性所必需的，使植物体内蛋白质合成的必要成分。同时植物体内过量积累Na+还会妨碍其对其他营养成分的吸收，破坏营养平衡。离子毒害会抑制细胞内酶的活性以及蛋白质的合成，干扰正常的代谢过程，从而造成植物的生理生化紊乱。而渗透胁迫主要表现为高浓度的Na+引起土壤水势下降，导致植物根系几乎无法吸收水分；同时根系吸收的Na+随水分蒸腾到达植物地上部，会在叶中积累，导致叶片产生坏死斑、并会缩短叶片寿命、影响光合作用、降低产量。盐胁迫导致的营养失衡、代谢以及渗透胁迫会进一步导致氧化胁迫，使光合作用及呼吸作用的电子链断裂，从而导致植株死亡。因此，植物对盐胁迫的适应性分子机制也主要表现为降低离子毒害、调控其体内的渗透平衡[2]。
正如盐对植物有多方面的影响，植物也有许多机制来抗盐。这些机制可分为三个主要的类别：1.渗透调节：植物利用能够减少植物地上部分增长的远距离信号进行调节，并且在地上部分积累Na+之前就启动[3]；2.离子调节：通过调节Na+和Cl在根部的转运过程减少它们两者在叶片中的积累[4]；3.组织调节：在这个过程中，植物内盐离子含量虽然很高，但是在细胞间和细胞内（特别是在液泡中）可被区室化，从而降低细胞中的盐浓度，减缓盐胁迫[5]。
植物对于盐胁迫的调节是非常复杂的，多种基因均参与其中。因此，对耐盐机制特性的研究是很有价值的[6]。而植物囊泡运输是这些机制发挥作用的重要步骤之一；囊泡运输和植物耐盐性之间的关系近年来也被众多研究所发现。
囊泡运输是不同细胞器之间传递物质的基本方式，分为4个重要步骤：囊泡的出芽、转运、拴系和融合。运输囊泡与受体膜之间的最初接触是由RAB GTPase和拴系因子介导的，拴系因子促使囊泡与受体膜靠近，使囊泡上的vSNARE与靶膜上的tSNARE形成四螺旋的SNARE复合体，从而导致磷脂双分子层的融合。拴系因子能够与SNARE、RAB等相互作用调控囊泡运输[7]。
RABs属于小GTP酶的亚家族,它能调节囊泡运输的多个步骤，包括囊泡出芽和将囊泡拴系到靶细胞膜上的过程[8]。同时，RABs也在通过招募马达蛋白来使囊泡运输和转运囊泡方面也起到了重要的作用。RABs在与GDP结合时的失活态和与GTP结合时的激活态之间循环，充当囊泡运输的分子开关[9]。
运输小泡被拴系在靶膜上之后，进入膜融合反应，这个过程由SNARE蛋白执行。 SNAREs是存在于所有真核生物中的蛋白质家族，其通过跨膜结构域或脂肪酰化锚定在囊泡或者靶膜上组装成一个紧密、稳定的复合物称为SNARE复合物[10]。组装成的SANRE复合物将运输小泡的膜双分子层和靶膜拉到足够近，让两个膜进行融合。四个SNARE蛋白质的特定结合，同时伴随由一个特定的RAB GTP酶调节的不同拴系复合物，赋予了膜融合的特异性[11]。
囊泡运输在植物适应胁迫方面具有重要作用。研究显示，小G蛋白ARA6能特异性地调控含VAMP727/SYP121的SNARE复合体的形成，介导从内体到质膜的运输；并且超表达ARA6Q93L使植物具有抗盐特性[12]。这些结果证明RAB5结合不同SNARE复合体，在储藏蛋白靶向液泡的运输或抵抗盐胁迫中发挥功能。植物拥有独特的囊泡运输网络，能够在特定的SNARE复合物和特定的RAB之间建立联系。
拟南芥中含有三个RAB5同源蛋白，RHA1和ARA7属于传统型，与人类RAB5C具有较高的同源性；ARA6则为植物所特有的RAB5蛋白[1315]。拟南芥中植物特有型的ARA6参与植物抗盐；水稻中含有两个与ARA6同源的植物特有型RAB蛋白（分别命名为RAB5b和RAB5d），在植物耐盐过程中的作用尚没有被完全阐明[16]。虽然人们对水稻抗盐进行了积极的研究，但水稻的抗盐机制还远未被解析，例如囊泡运输和水稻抗盐性之间的关系几乎是一个研究空白。为了给水稻遗传改良提供更好的信息，本文欲对水稻中植物特有型RAB5蛋白（OsRAB5b、OsRAB5d）是否参与耐盐途径，以及植物特有型RAB5介导耐盐途径的可能机制进行探究。
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