外生菌根真菌对重金属Cd耐性的研究
外生菌根真菌对重金属Cd耐性的研究[20200614171421]
摘要：在固体培养条件下，研究了不同浓度重金属Cd对26种外生菌根真菌生长的影响，从中挑选出Cd耐性和敏感菌株，然后在液体培养条件下，研究不同浓度Cd对耐性和敏感菌株生长的影响以及两种菌株对重金属的吸收。结果表明：培养后培养基质的pH都下降，并且耐性菌株的pH显著低于敏感菌株。同时比较了菌丝每干重生物量吸收的Cd含量，结果发现耐性菌株吸收的Cd含量显著低于敏感菌株。
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关键字:外生菌根真菌；重金属Cd；半抑制浓度；耐性菌株；生物量
目录
摘要 3
关键词 3
引言 3
1 材料与方法 4
1.1 供试菌株 5
1.2 实验设计 5
1.2.1 Cd耐性和敏感菌株的筛选 5
1.2.2 Cd对耐性菌株和敏感菌株生长的影响 5
1.3 测定项目与方法 5
1.4 数据分析 6
2 结果与分析 6
2.1 Cd耐性和敏感菌株的筛选 6
2.2 Cd对两种外生菌根真菌的生长影响 7
2.2.1 不同浓度重金属Cd处理后两种外生菌根真菌生物量的变化 7
2.3 外生菌根真菌对重金属Cd的吸收变化 9
3 结论与讨论 10
致谢： 11
参考文献 11
外生菌根真菌对重金属Cd 耐性的研究
引言
引言
由于人类活动的快速扩张以及Cd的难降解性，土壤中的Cd浓度持续上升（Clemens et al.2013）。Cd对于大部分生物都是剧毒重金属。土壤中的Cd会被植物吸收并最终通过食物链进入人体（Kaplan,Ince & Yaman 2011）。环境中Cd的富集以及它的毒性给人类健康带来了很大的威胁（Nawrot et al.2006）。因此，治理Cd污染及修复Cd污染土壤极为重要。
传统的土壤修复方法主要有物理和化学方法。物理和化学修复是利用污染物的物理、化学特性，通过分离、固定以及改变存在状态等方式，将污染物从土壤中去除（蒋小红等，2006）。但传统的物理、化学修复也存在着修复费用高昂、易产生二次污染、破坏土壤及微生物结构等缺点，制约了此方法从实验室向大规模应用的转化（庄绪亮，2007）。于是有 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
人提出了生物修复。生物修复就是利用微生物、植物和动物将土壤中的污染物转化、吸附或富集的生物工程技术系统。生物修复具有成本低、不破坏土壤环境、污染物降解效率高、不产生二次污染、可原地处理、操作简单等优点，随着对土壤修复的要求的提高，生物修复越来越引起人们的重视。
生物修复中最常使用的微生物就是菌根真菌。植物根系与一类土壤真菌形成的互惠共生体称作菌根，参与形成菌根的真菌就是菌根真菌。根据菌根形态解剖特征、菌根真菌种类和植物种类，通常将菌根分为丛枝菌根（AM）、外生菌根（ECM）、内外菌根（EEM）、浆果鹃类菌根（ARM）、水晶兰类菌根（MM）、欧石南类菌根（ERM）和兰科菌根（OM）（刘润进，陈应龙，2007）。相应的外生菌根真菌也可以分为这7类。本实验室常用的菌根真菌是外生菌根真菌，主要与松树共生。
外生菌根真菌能和植物根尖形成共生结构，并为植物能带来益处（Dahlberg A，2000）。外生菌根真菌能改善植物营养。实验发现外生菌根真菌能将土壤中有机磷水解为正磷酸盐，从而使植物能够吸收利用磷（Pasqualini et al. 1992)。 Turgeman et al.（2011）发现接种了沙漠松露后，Helianthemum sessiliflorum对水的利用率提高，促进了宿主植物在干旱环境下的正常生长。Krznaric et al.(2009)发现在重金属污染土壤中，外生菌根真菌能降低重金属毒性从而促进植物在重金属尤其是有毒重金属污染土壤的生长。但是在重金属污染带，外生菌根真菌是怎样降低重金属的毒性从而改善植物的营养和生长状况的呢？要了解这个机理，我们先在纯培养条件下研究外生菌根真菌在重金属Cd的耐性机理。
本实验选取了25种实验室纯化保存的外生菌根真菌菌株，通过3个浓度的Cd处理，从中筛选出合适的耐性和敏感菌株。然后再在液体培养条件下，用一系列浓度梯度的Cd处理两种菌株，旨在了解Cd对外生菌根真菌的生长影响及外生菌根真菌对Cd的耐性机理。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
25种供试菌株保存在大学生命科学学院植物营养实验室，它们均采自于未受重金属污染的土壤。
在25℃的条件下，采用改良MMN（Marx,1969）固体培养基暗培养菌株15d后备用。培养基组成为：10g/L 葡萄糖、3g/L Malt extract、 0.25g/L（NH4）2HPO4、 0.5g/L KH2PO4、 0.15g/L MgSO47H2O、 0.05g/L CaCl2、 0.03g/L FeCl36H2O、 0.025g/L NaCl、 0.1mg/L VB1、 14g/L 琼脂。pH 5.80。
1.2 实验设计
1.2.1 Cd耐性和敏感菌株的筛选
以CdCl2 5/2H2O（分析纯）配置10mg/ml的Cd母液，用无菌的水相滤膜（0.22μm）过滤，4℃冰箱保存备用。
配置MMN固体培养基，分装到200ml三角瓶中，每瓶中加入100ml，然后121℃高压蒸汽灭菌15min。稍冷却后加入上述Cd母液，形成0, 40，80mg/l的3种处理，然后每瓶分装到3个灭菌的9cm皮氏培养皿中。冷却后每个皮氏培养皿中间接种一块直径为8mm的圆形固体菌块，每种菌株每种处理下3个重复，对照组不添加菌块，其他过 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
程一样。25℃下暗培养，一个星期后观察它们生长情况。
1.2.2 Cd对耐性菌株和敏感菌株生长的影响
配置MMN液体培养基，取20ml分装到50ml三角瓶中，121℃高压蒸汽灭菌15min，冷却后加入上述Cd母液，分别形成0,5,10,20,30,40,50mg/l浓度梯度的Cd处理，然后每瓶中接种3块直径8mm的圆形固体菌块，25℃暗培养7d。每种菌株每个处理重复3次。
1.3 测定项目与方法
真菌生物量的测定：试验结束后，液体培养基中的真菌菌丝先用滤纸抽滤，然后用去离子水冲洗三次。80℃烘干至恒重，然后用万分之一天平称重。
pH测定：收集过滤后的滤液，用HANNA HI2221 pH计测定pH。
菌丝吸收重金属含量测定：烘干后的菌丝用87:13的HNO3：HClO4（v/v）消煮，消煮液用2.5% HNO3定容至5ml，用原子吸收分光光度计（ novAA 400,jena）测定菌丝吸收重金属Cd的含量。
1.4 数据分析
用Excel对试验数据进行基本计算，SPSS软件进行统计分析，显著水平为5%。
2 结果与分析
2.1 Cd耐性和敏感菌株的筛选
对25株外生菌根真菌进行3种浓度（0,40,80 mg/L）的Cd处理7天后，观察它们在固体MMN培养基上的生长状态及它们在空白处理中的横向生长速度。结果表明在40mg/L Cd处理下，只有G11生长没有明显的抑制，G3、G7、G9、G13、G14、G15、G16、G17、G18、G23、G24、G25、G28、G37、G38、G39、G43、G44生长受抑制，其它6种外生菌根真菌生长明显受抑制，几乎没有生长；在80mg/L Cd处理下，只有G11还有生长，生长受抑制，其它24种外生菌根真菌没有生长（表1）。实验又比较了25株外生菌根真菌在没有Cd处理的MMN固体培养基中的生长速率，结果显示G7、G9、G11、G13、G14、G15、G16、G26、G37、G38、G39、G43、G44这13种外生菌根真菌生长速率很快，生长7天后，直径都能达到3cm（原始菌斑6mm）以上，适合于后续试验，而另外12种外生菌根真菌生长速率缓慢，生长7天直径在3cm以上部分甚至没有生长。
摘要：在固体培养条件下，研究了不同浓度重金属Cd对26种外生菌根真菌生长的影响，从中挑选出Cd耐性和敏感菌株，然后在液体培养条件下，研究不同浓度Cd对耐性和敏感菌株生长的影响以及两种菌株对重金属的吸收。结果表明：培养后培养基质的pH都下降，并且耐性菌株的pH显著低于敏感菌株。同时比较了菌丝每干重生物量吸收的Cd含量，结果发现耐性菌株吸收的Cd含量显著低于敏感菌株。
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关键字:外生菌根真菌；重金属Cd；半抑制浓度；耐性菌株；生物量
目录
摘要 3
关键词 3
引言 3
1 材料与方法 4
1.1 供试菌株 5
1.2 实验设计 5
1.2.1 Cd耐性和敏感菌株的筛选 5
1.2.2 Cd对耐性菌株和敏感菌株生长的影响 5
1.3 测定项目与方法 5
1.4 数据分析 6
2 结果与分析 6
2.1 Cd耐性和敏感菌株的筛选 6
2.2 Cd对两种外生菌根真菌的生长影响 7
2.2.1 不同浓度重金属Cd处理后两种外生菌根真菌生物量的变化 7
2.3 外生菌根真菌对重金属Cd的吸收变化 9
3 结论与讨论 10
致谢： 11
参考文献 11
外生菌根真菌对重金属Cd 耐性的研究
引言
引言
由于人类活动的快速扩张以及Cd的难降解性，土壤中的Cd浓度持续上升（Clemens et al.2013）。Cd对于大部分生物都是剧毒重金属。土壤中的Cd会被植物吸收并最终通过食物链进入人体（Kaplan,Ince & Yaman 2011）。环境中Cd的富集以及它的毒性给人类健康带来了很大的威胁（Nawrot et al.2006）。因此，治理Cd污染及修复Cd污染土壤极为重要。
传统的土壤修复方法主要有物理和化学方法。物理和化学修复是利用污染物的物理、化学特性，通过分离、固定以及改变存在状态等方式，将污染物从土壤中去除（蒋小红等，2006）。但传统的物理、化学修复也存在着修复费用高昂、易产生二次污染、破坏土壤及微生物结构等缺点，制约了此方法从实验室向大规模应用的转化（庄绪亮，2007）。于是有 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
人提出了生物修复。生物修复就是利用微生物、植物和动物将土壤中的污染物转化、吸附或富集的生物工程技术系统。生物修复具有成本低、不破坏土壤环境、污染物降解效率高、不产生二次污染、可原地处理、操作简单等优点，随着对土壤修复的要求的提高，生物修复越来越引起人们的重视。
生物修复中最常使用的微生物就是菌根真菌。植物根系与一类土壤真菌形成的互惠共生体称作菌根，参与形成菌根的真菌就是菌根真菌。根据菌根形态解剖特征、菌根真菌种类和植物种类，通常将菌根分为丛枝菌根（AM）、外生菌根（ECM）、内外菌根（EEM）、浆果鹃类菌根（ARM）、水晶兰类菌根（MM）、欧石南类菌根（ERM）和兰科菌根（OM）（刘润进，陈应龙，2007）。相应的外生菌根真菌也可以分为这7类。本实验室常用的菌根真菌是外生菌根真菌，主要与松树共生。
外生菌根真菌能和植物根尖形成共生结构，并为植物能带来益处（Dahlberg A，2000）。外生菌根真菌能改善植物营养。实验发现外生菌根真菌能将土壤中有机磷水解为正磷酸盐，从而使植物能够吸收利用磷（Pasqualini et al. 1992)。 Turgeman et al.（2011）发现接种了沙漠松露后，Helianthemum sessiliflorum对水的利用率提高，促进了宿主植物在干旱环境下的正常生长。Krznaric et al.(2009)发现在重金属污染土壤中，外生菌根真菌能降低重金属毒性从而促进植物在重金属尤其是有毒重金属污染土壤的生长。但是在重金属污染带，外生菌根真菌是怎样降低重金属的毒性从而改善植物的营养和生长状况的呢？要了解这个机理，我们先在纯培养条件下研究外生菌根真菌在重金属Cd的耐性机理。
本实验选取了25种实验室纯化保存的外生菌根真菌菌株，通过3个浓度的Cd处理，从中筛选出合适的耐性和敏感菌株。然后再在液体培养条件下，用一系列浓度梯度的Cd处理两种菌株，旨在了解Cd对外生菌根真菌的生长影响及外生菌根真菌对Cd的耐性机理。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
25种供试菌株保存在大学生命科学学院植物营养实验室，它们均采自于未受重金属污染的土壤。
在25℃的条件下，采用改良MMN（Marx,1969）固体培养基暗培养菌株15d后备用。培养基组成为：10g/L 葡萄糖、3g/L Malt extract、 0.25g/L（NH4）2HPO4、 0.5g/L KH2PO4、 0.15g/L MgSO47H2O、 0.05g/L CaCl2、 0.03g/L FeCl36H2O、 0.025g/L NaCl、 0.1mg/L VB1、 14g/L 琼脂。pH 5.80。
1.2 实验设计
1.2.1 Cd耐性和敏感菌株的筛选
以CdCl2 5/2H2O（分析纯）配置10mg/ml的Cd母液，用无菌的水相滤膜（0.22μm）过滤，4℃冰箱保存备用。
配置MMN固体培养基，分装到200ml三角瓶中，每瓶中加入100ml，然后121℃高压蒸汽灭菌15min。稍冷却后加入上述Cd母液，形成0, 40，80mg/l的3种处理，然后每瓶分装到3个灭菌的9cm皮氏培养皿中。冷却后每个皮氏培养皿中间接种一块直径为8mm的圆形固体菌块，每种菌株每种处理下3个重复，对照组不添加菌块，其他过 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
程一样。25℃下暗培养，一个星期后观察它们生长情况。
1.2.2 Cd对耐性菌株和敏感菌株生长的影响
配置MMN液体培养基，取20ml分装到50ml三角瓶中，121℃高压蒸汽灭菌15min，冷却后加入上述Cd母液，分别形成0,5,10,20,30,40,50mg/l浓度梯度的Cd处理，然后每瓶中接种3块直径8mm的圆形固体菌块，25℃暗培养7d。每种菌株每个处理重复3次。
1.3 测定项目与方法
真菌生物量的测定：试验结束后，液体培养基中的真菌菌丝先用滤纸抽滤，然后用去离子水冲洗三次。80℃烘干至恒重，然后用万分之一天平称重。
pH测定：收集过滤后的滤液，用HANNA HI2221 pH计测定pH。
菌丝吸收重金属含量测定：烘干后的菌丝用87:13的HNO3：HClO4（v/v）消煮，消煮液用2.5% HNO3定容至5ml，用原子吸收分光光度计（ novAA 400,jena）测定菌丝吸收重金属Cd的含量。
1.4 数据分析
用Excel对试验数据进行基本计算，SPSS软件进行统计分析，显著水平为5%。
2 结果与分析
2.1 Cd耐性和敏感菌株的筛选
对25株外生菌根真菌进行3种浓度（0,40,80 mg/L）的Cd处理7天后，观察它们在固体MMN培养基上的生长状态及它们在空白处理中的横向生长速度。结果表明在40mg/L Cd处理下，只有G11生长没有明显的抑制，G3、G7、G9、G13、G14、G15、G16、G17、G18、G23、G24、G25、G28、G37、G38、G39、G43、G44生长受抑制，其它6种外生菌根真菌生长明显受抑制，几乎没有生长；在80mg/L Cd处理下，只有G11还有生长，生长受抑制，其它24种外生菌根真菌没有生长（表1）。实验又比较了25株外生菌根真菌在没有Cd处理的MMN固体培养基中的生长速率，结果显示G7、G9、G11、G13、G14、G15、G16、G26、G37、G38、G39、G43、G44这13种外生菌根真菌生长速率很快，生长7天后，直径都能达到3cm（原始菌斑6mm）以上，适合于后续试验，而另外12种外生菌根真菌生长速率缓慢，生长7天直径在3cm以上部分甚至没有生长。
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