水稻不育突变体f287的图位克隆及功能预测
通过对宁粳4号进行甲磺酸乙酯（EMS）诱变，得到一隐性雄性不育突变体f287。形态学观察结果表明该突变体无法正常结实，稻壳为绿色，花药弱小发白。经I2-KI花粉染色后也未能观察到染色花粉粒。利用不育突变体f287与dular杂交所得的F2群体中的169个隐性极端个体，将该突变基因定位于第9条染色体长臂的E19-10和P13-5分子标记之间，物理距离约为307kb，在该定位区间内没有报导过的不育基因。推测该不育基因是新的不育基因，调控水稻花粉的早期发育。本研究为该不育基因的图位克隆及功能解析奠定了基础。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言（或绪论）2
1材料与方法4
1.1材料 4
1.1.1 实验材料4
1.1.2 主要实验试剂及配置4
1.1.3 主要实验用品与设备5
1.2方法 5
1.2.1 I2KI染色法观察花粉育性5
1.2.2 DNA样品制备6
1.2.3分子标记检测5
1.2.4凝胶电泳和检测6
1.2.5新标记的开发6
1.2.6目标区域基因预测及序列测定6
2结果与分析7
2.1 f287的表型分析7
2.2 f287的遗传分析8
2.3 f287基因的连锁分析和精细定位8
2.4候选基因分析9
3讨论9
致谢10
参考文献11
附录12
水稻不育突变体f287的图位克隆及功能分析
引言
水稻是全球重要的粮食作物。从20世纪末开始，以雄性不育为基础的杂交水稻育种技术极大地提升了水稻产量，在很大程度上缓解了世界粮食紧张问题，而水稻的雄性不育是我们有效利用杂种优势的前提和基础[1]。筛选并研究新的水稻雄性不育突变体，可以帮助我们分离花粉/花药发育相关基因，对于揭示水稻雄配子发育调控网络具有重要意义，有助于开发新一代不育系进一步利用水稻杂种优势。
水稻是禾本科作物的代表，其花为颖花，由雌蕊、雄蕊、 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
浆片和内颖外颖组成 [2]。花药和花丝构成了水稻的雄性生殖器官即雄蕊。雄蕊由雄蕊原基经细胞分裂、细胞分化而来。花丝的结构简单，最外层为表皮，内层为薄壁组织，中央有维管束可以与花药联通[3]。来源于花分生组织的花药原基包含了L1L3三层细胞层[4]。随后，L1层分化为花药的表皮细胞层，L2层分化成造孢细胞和药室内壁层、中层、绒毡层共同组成的三层内部体细胞层，L3层最终分化为连接组织[5](图1)。张大兵等通过对不同发育时期水稻(粳稻品种9522和Zhonghua 11)切片进行观察分析，将水稻花药发育过程分成14个时期，其中时期15，是雄蕊原基的分化和分裂阶段；时期69，是花粉母细胞减数分裂和四分体形成阶段；时期1011，是小孢子有丝分裂阶段；时期1214，是有花粉继续成熟并完成释放的阶段[6]。这14个阶段中任何一个阶段出现异常都可以引起花药异常并导致花粉败育。
图1 水稻的花药原基和雄蕊
(引自Specification of tapetum and microsporocyte cells within the anther)
花药原基有L1, L2,L3三层细胞:L1分化为表皮细胞(E)，L2细胞产生药室内壁(En)，中层(ML)，绒毡层(T)和造孢细胞(Sp);L3形成连接组织。ACD:不对称细胞分裂;Ar:孢原细胞;fm:花分生组织;Le:外颖;L2d:L2衍生细胞;pa:内颖;PPC:初生壁细胞;SCD:对称细胞分裂;gl:颖片;SPC:次生壁细胞;st:雄蕊。
水稻雄性不育是指水稻雌蕊发育正常但雄蕊在发育过程中出现结构或功能异常，进而导致雄蕊丧失授粉或授精能力的现象[7]，根据造成雄性不育原因的不同，可以将雄性不育分为细胞核雄性不育和细胞质雄性不育（包括核质互作不育）2种类型。其中，细胞核雄性不育又包括显性核不育与隐性核不育2类。根据育性是否受光照、温度等外界条件影响，核不育又可以分为光（温）敏核不育和普通核不育2种类型。细胞核雄性不育是一种可遗传的基因突变。研究表明大多数的调控雄性育性的基因为核基因[8]。核基因与胞质基因竞相传递自身遗传物质形成矛盾就会造成胞质雄性不育。目前已经报道的雄性胞质不育基因多达35种，但是应用于生产的较少，研究较为深入的主要有野败型、矮败型等，其不育主要是由于线粒体基因造成的[9]。
合理利用雄性不育系，不仅能够节省人工去雄的工作量，提高去雄成功率，降低生产杂交种种子成本，还能够充分发挥杂种优势的作用[10]。因此，水稻雄性不育的发现与利用为增加水稻产量，改进水稻品质提供优异种源，因而在植物育种上具有重要的应用价值[11]。同时水稻作为模式植物，对其基因功能研究更加有利于我们对更大更复杂谷物类植物基因功能的研究，对缓解全球粮食紧张问题有巨大作用。
剑桥大学Alan Coulson最早提出图位克隆(定位克隆)这一基本概念[12]。图位克隆作为正向遗传学研究方法，可以在基因序列未知且基因表达产物不明的情况下根据各基因在染色体上位置的不同来达到分离不同基因的目的。在基因组中，各基因均具有相对稳定的基因座，根据目的基因与染色体上已知位置分子标记的连锁关系来判定目的基因在该染色体上的具体位置。由分子标记的带型和具体物理位置进行分析并构建目的基因附近区域的物理图谱，随后通过染色体步移寻找更多与目的基因连锁的标记，尽量缩小目的基因的范围直至找到该目的基因的准确位置。
虽然通过图位克隆已经对很多水稻雄性不育基因进行定位和功能分析，但是导致水稻雄性不育的基因间的相互作用机理仍然不清楚，且有很多雄性不育个体很难通过图位克隆分离定位比如：该不育性状由不止一个基因位点进行控制，或该不育性状是由于表观遗传原因造成的。位于或接近染色体着丝粒的基因也很难通过图位克隆进行定位。但是随着各种生物技术和生物信息学手段的快速发展，越来越多水稻基因组全测序的公布，水稻基因组学研究进展也更加明朗。新型分子标记的开发、新一代测序手段的发展、数量庞大的EST、全长cDNA 等序列及功能分析数据的释放都能够为基因的图位克隆注入新的发展动力。使得遗传图谱与物理图谱的构建的工作量大大减少，使得图位克隆技术向着快速简单的方向发展[13]。
本研究从表型和遗传等方面对雄性不育突变体f287进行鉴定，明确了相应的遗传特性，并对突变基因进行了精细定位，通过对突变体的研究有利于进一步了解水稻雄性不育的分子机理，为水稻雄性不育的有效利用提供理论依据。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言（或绪论）2
1材料与方法4
1.1材料 4
1.1.1 实验材料4
1.1.2 主要实验试剂及配置4
1.1.3 主要实验用品与设备5
1.2方法 5
1.2.1 I2KI染色法观察花粉育性5
1.2.2 DNA样品制备6
1.2.3分子标记检测5
1.2.4凝胶电泳和检测6
1.2.5新标记的开发6
1.2.6目标区域基因预测及序列测定6
2结果与分析7
2.1 f287的表型分析7
2.2 f287的遗传分析8
2.3 f287基因的连锁分析和精细定位8
2.4候选基因分析9
3讨论9
致谢10
参考文献11
附录12
水稻不育突变体f287的图位克隆及功能分析
引言
水稻是全球重要的粮食作物。从20世纪末开始，以雄性不育为基础的杂交水稻育种技术极大地提升了水稻产量，在很大程度上缓解了世界粮食紧张问题，而水稻的雄性不育是我们有效利用杂种优势的前提和基础[1]。筛选并研究新的水稻雄性不育突变体，可以帮助我们分离花粉/花药发育相关基因，对于揭示水稻雄配子发育调控网络具有重要意义，有助于开发新一代不育系进一步利用水稻杂种优势。
水稻是禾本科作物的代表，其花为颖花，由雌蕊、雄蕊、 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
浆片和内颖外颖组成 [2]。花药和花丝构成了水稻的雄性生殖器官即雄蕊。雄蕊由雄蕊原基经细胞分裂、细胞分化而来。花丝的结构简单，最外层为表皮，内层为薄壁组织，中央有维管束可以与花药联通[3]。来源于花分生组织的花药原基包含了L1L3三层细胞层[4]。随后，L1层分化为花药的表皮细胞层，L2层分化成造孢细胞和药室内壁层、中层、绒毡层共同组成的三层内部体细胞层，L3层最终分化为连接组织[5](图1)。张大兵等通过对不同发育时期水稻(粳稻品种9522和Zhonghua 11)切片进行观察分析，将水稻花药发育过程分成14个时期，其中时期15，是雄蕊原基的分化和分裂阶段；时期69，是花粉母细胞减数分裂和四分体形成阶段；时期1011，是小孢子有丝分裂阶段；时期1214，是有花粉继续成熟并完成释放的阶段[6]。这14个阶段中任何一个阶段出现异常都可以引起花药异常并导致花粉败育。
图1 水稻的花药原基和雄蕊
(引自Specification of tapetum and microsporocyte cells within the anther)
花药原基有L1, L2,L3三层细胞:L1分化为表皮细胞(E)，L2细胞产生药室内壁(En)，中层(ML)，绒毡层(T)和造孢细胞(Sp);L3形成连接组织。ACD:不对称细胞分裂;Ar:孢原细胞;fm:花分生组织;Le:外颖;L2d:L2衍生细胞;pa:内颖;PPC:初生壁细胞;SCD:对称细胞分裂;gl:颖片;SPC:次生壁细胞;st:雄蕊。
水稻雄性不育是指水稻雌蕊发育正常但雄蕊在发育过程中出现结构或功能异常，进而导致雄蕊丧失授粉或授精能力的现象[7]，根据造成雄性不育原因的不同，可以将雄性不育分为细胞核雄性不育和细胞质雄性不育（包括核质互作不育）2种类型。其中，细胞核雄性不育又包括显性核不育与隐性核不育2类。根据育性是否受光照、温度等外界条件影响，核不育又可以分为光（温）敏核不育和普通核不育2种类型。细胞核雄性不育是一种可遗传的基因突变。研究表明大多数的调控雄性育性的基因为核基因[8]。核基因与胞质基因竞相传递自身遗传物质形成矛盾就会造成胞质雄性不育。目前已经报道的雄性胞质不育基因多达35种，但是应用于生产的较少，研究较为深入的主要有野败型、矮败型等，其不育主要是由于线粒体基因造成的[9]。
合理利用雄性不育系，不仅能够节省人工去雄的工作量，提高去雄成功率，降低生产杂交种种子成本，还能够充分发挥杂种优势的作用[10]。因此，水稻雄性不育的发现与利用为增加水稻产量，改进水稻品质提供优异种源，因而在植物育种上具有重要的应用价值[11]。同时水稻作为模式植物，对其基因功能研究更加有利于我们对更大更复杂谷物类植物基因功能的研究，对缓解全球粮食紧张问题有巨大作用。
剑桥大学Alan Coulson最早提出图位克隆(定位克隆)这一基本概念[12]。图位克隆作为正向遗传学研究方法，可以在基因序列未知且基因表达产物不明的情况下根据各基因在染色体上位置的不同来达到分离不同基因的目的。在基因组中，各基因均具有相对稳定的基因座，根据目的基因与染色体上已知位置分子标记的连锁关系来判定目的基因在该染色体上的具体位置。由分子标记的带型和具体物理位置进行分析并构建目的基因附近区域的物理图谱，随后通过染色体步移寻找更多与目的基因连锁的标记，尽量缩小目的基因的范围直至找到该目的基因的准确位置。
虽然通过图位克隆已经对很多水稻雄性不育基因进行定位和功能分析，但是导致水稻雄性不育的基因间的相互作用机理仍然不清楚，且有很多雄性不育个体很难通过图位克隆分离定位比如：该不育性状由不止一个基因位点进行控制，或该不育性状是由于表观遗传原因造成的。位于或接近染色体着丝粒的基因也很难通过图位克隆进行定位。但是随着各种生物技术和生物信息学手段的快速发展，越来越多水稻基因组全测序的公布，水稻基因组学研究进展也更加明朗。新型分子标记的开发、新一代测序手段的发展、数量庞大的EST、全长cDNA 等序列及功能分析数据的释放都能够为基因的图位克隆注入新的发展动力。使得遗传图谱与物理图谱的构建的工作量大大减少，使得图位克隆技术向着快速简单的方向发展[13]。
本研究从表型和遗传等方面对雄性不育突变体f287进行鉴定，明确了相应的遗传特性，并对突变基因进行了精细定位，通过对突变体的研究有利于进一步了解水稻雄性不育的分子机理，为水稻雄性不育的有效利用提供理论依据。
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