昆虫病原线虫共生菌SerratianematodiphilaR186与黑腹果蝇体液免疫系统的互作研究
昆虫病原线虫共生菌SerratianematodiphilaR186与黑腹果蝇体液免疫系统的互作研究[20200614172059]
摘要：Serratia nematodiphila R186是长三角地区广泛存在的 Heterorhabditidoides类昆虫病原线虫具有较强杀虫活性的共生菌株。本研究通过饲喂和针扎的方式造成野生型黑腹果蝇及其不同体液免疫途径突变体的肠道和血腔侵染。统计两种侵染条件下各个突变体的存活率，同时进行血腔中共生菌菌落计数，荧光定量检测两类抗菌肽Diptericin，Drosomycin的表达情况。结果发现两种侵染条件下R186均可单独导致果蝇的死亡。试验中果蝇的imd途径Dredd免疫突变体对R186的敏感度高于野生型和Toll途径Dif突变体，血腔菌落计数水平也较高，抗菌肽Diptericin表达显著降低。表明应对Serratia nematodiphila R186侵染的主要体液免疫途径是imd途径。同时在肠道侵染试验中两个免疫途径突变体间的死亡率差距缩小趋于一致，可能暗示在这种侵染模式中，Serratia nematodiphila R186存在某种对免疫系统的逃逸机制或其通过释放的毒素蛋白这样与宿主对细菌免疫无关的方式杀死侵染对象。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
关键字:病原线虫共生菌；果蝇；体液免疫
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words: 3
引言 4
1 实验材料与方法 5
1．2．1果蝇培养与扩繁 6
1．2．2 共生菌对果蝇肠道侵染的实验 6
1．2．2. 1 共生菌对果蝇的肠道侵染 6
1．2．2. 2 肠道侵染的致死率和菌落cfu统计 6
1．2．3 共生菌对果蝇血腔侵染的实验 6
1．2．3. 1 共生菌对果蝇的血腔侵染 6
1．2．3. 2 肠道侵染的致死率和菌落cfu统计 6
1．2．3. 3 RNA提取与荧光定量试验 6
2 结果与分析 7
2．1 昆虫病原线虫共生菌R186对野生型果蝇的血腔侵染与肠道侵染实验 7
2．2 昆虫病原线虫共生菌R186对体液免疫突变体果蝇的血腔侵染 8
2．3 昆虫病原线虫共生菌R186对体液免疫突变体果蝇的肠道侵染 9
3 讨论 10
3．1 共生菌Serratia nematodiphila R186对侵染昆虫具有致死能力。在Heterorhabditidoides-Serratia共生体中起主要杀虫作用。 10
3．2 体液免疫中，imd途径在在抵抗共生菌Serratia nematodiphila中起主要作用。 11
致谢 11
参考文献： 12
附录 13
昆虫病原线虫共生菌Serratia nematodiphila R186与黑腹果蝇体液免疫系统的互作研究
引言
引言
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
/> 绿色农业是目前的农业发展趋势和整个社会对农产品的要求。实现绿色农业的一大瓶颈在于用无公害方法实现对于害虫的有效控制。毒性低、残留少、降解容易、对环境无不良影响的生物农药的研究受到关注，新型生物杀虫剂有望成为控制作物虫害、保障食品安全的根本途径之一[1,2]。
在昆虫体内存在具有抗病原微生物的先天性免疫系统。其中体液免疫存在2种病原体识别信号通路：Imd 途径和Toll途径[18,19]（图1）。Imd途径对革兰氏阴性菌敏感。Imd途径的重要组成部分有PGRP-LC脂多糖识别受体[20]，dFADD受体[21]，PREDD半胱天冬酶[22]，Relish转录因子[23]等。这些因子发生突变将会造成类似与imd缺陷的效果。抗菌肽中，Diptericin的表达依赖于Imd途径。本实验选用该途径的具有代表性的PGRP-LC，PREDD，Relish突变体进行试验。Toll途径对真菌和革兰氏阳性菌敏感。Toll途径上的Dif位点主要功能为激活抗菌肽Drosomycin 的表达[18,19]。Heterorhabditidoides 类昆虫病原线虫共生菌 Serratia nematodiphila 为革兰氏阴性菌。Aymeric[23]等的研究发现Photorhabdus luminescens 和 Xenorhabdus nematophila 是通过避开果蝇的imd免疫途径发挥其败血毒性从而杀死宿主昆虫的。Nadine[24]等的研究证实了昆虫病原菌可以通过肠道侵染致死果蝇，并提供了一些试验方法。这些相关的基础研究为本研究提供了理论基础与方法参考。
本研究通过肠道侵染与血腔侵染，分析Serratia nematodiphila与黑腹果蝇的体液免疫的互作机制。为深入研究Heterorhabditidoides-Serratia 类昆虫病原线虫共生体的杀虫机理提供参考，为这一共生体在生物防治中的实际应用提供理论依据。
图1 Drosophila 体液免疫的Toll 和IMD 信号通路[8,]
Fig. 1 Toll and IMD singling pathway of hormone immunity in Drosophila
1 实验材料与方法
1．1 实验材料
1．1．2 实验试剂及用品 酵母提取物、胰蛋白胨、氯化钠、琼脂粉、氨苄青霉素、Trizol、无水乙醇、氯仿、异丙醇、乙醚、蔗糖、玉米粉、酵母粉、丙酸、琼脂条、琼脂糖、DEPC、反转录试剂盒BioTeke supermoⅢ RT Kit（百泰克公司）、PCR试剂盒、荧光定量试剂UltraSYBR Mixture（With ROX）（康为世纪公司）、滤纸、钨针、放大镜。
1．1．3 实验仪器 智能人工气候箱（PRX-450B，宁波海曙赛福实验仪器厂）、恒温培养箱（PSX-280H型恒温恒湿培养箱，浙江宁波莱福）、 ABI7500荧光定量PCR仪、普通PCR仪、 高速冷冻离心机（Eppendorf）、电子天平（AR2130，OHAVS，Ohavs Corp.Pine Brook，NJ，USA）、高压灭菌锅、摇床、超低温冰箱、超净工作台。
1．2 实验方法
1．2．1果蝇培养与扩繁
以实验室购买并保存的野生型和PG *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
RP-LC，PREDD，Relish和Dif突变体黑腹果蝇为种蝇。在经过灭菌处理的果蝇培养指管中注入约1厘米高的无菌果蝇培养基，在管身用记号笔注明该管培养的果蝇类型及接种时间。每只培养指管放入十只左右性别大致对等的与管身标记对应的野生型或突变体种蝇，以灭菌棉塞塞住管口以防止果蝇逃逸及外界杂菌污染并保证空气流通。将接种好的培养管放入果蝇培养箱培养，培养的温度为25℃，湿度75%，光照2000lx，光照周期12小时。待培养基中出现大量肉眼可见的果蝇幼虫时，即可将管中成虫转移至新的培养管。依此重复，直至培养数量可满足实验要求为止。
1．2．2 共生菌对果蝇肠道侵染的实验
1．2．2. 1 共生菌对果蝇的肠道侵染
用保存的R187菌种划线，37℃培养12小时后，取单菌落接入LB液体培养基至于震荡摇床，37℃，200rpm/min 振荡培养24小时。将发酵的菌液以5000rpm离心10min，用无菌水清洗菌体沉淀，并用50mM蔗糖水将菌体重新悬浮，调整OD600为0.1。
将滤纸折叠后放入果蝇培养管底部，加上棉塞后，进行高压灭菌，灭菌后烘干，使滤纸片干燥。将50mM蔗糖水菌悬液1ml加入到滤纸片上，从进行实验的野生型或突变体果蝇中选取孵化6-7天的雌性个体15只用乙醚麻醉后转移到该种果蝇培养管中。至于培养箱中培养。本实验以相同处理得到的OD值相同的E.coli菌悬液处理的果蝇作为对照，每个实验至少进行3组重复。
1．2．2. 2 肠道侵染的致死率和菌落cfu统计
每12小时观察接受实验的野生型，imd途径PGRP-LC，PREDD，Relish突变体和Toll途径Dif突变体黑腹果蝇的存活率情况，记录数据。每24小时取尚幸存果蝇，麻醉后用医用酒精淋洗除去体表细菌，切除腹部，取头胸部研磨，匀浆梯度稀释涂布氨苄平板观察菌落生长情况，每个梯度实验至少进行3组重复。
由昆虫病原线虫共生菌单独造成的的肠道侵染与血腔侵染都可导致受试果蝇的死亡，而非果蝇病原菌的大肠杆菌在两种侵染条件下对果蝇的生存没有显著影响(图2)。比较不同侵染方式的结果可以发现，共生菌R186肠道侵染的致死速率要远远慢于血腔侵染。可能的原因是在在肠道侵染模式下共生菌及其产生的杀虫毒素需要穿透果蝇肠道壁才能进入血腔，从而延缓了共生菌致死的速度。
摘要：Serratia nematodiphila R186是长三角地区广泛存在的 Heterorhabditidoides类昆虫病原线虫具有较强杀虫活性的共生菌株。本研究通过饲喂和针扎的方式造成野生型黑腹果蝇及其不同体液免疫途径突变体的肠道和血腔侵染。统计两种侵染条件下各个突变体的存活率，同时进行血腔中共生菌菌落计数，荧光定量检测两类抗菌肽Diptericin，Drosomycin的表达情况。结果发现两种侵染条件下R186均可单独导致果蝇的死亡。试验中果蝇的imd途径Dredd免疫突变体对R186的敏感度高于野生型和Toll途径Dif突变体，血腔菌落计数水平也较高，抗菌肽Diptericin表达显著降低。表明应对Serratia nematodiphila R186侵染的主要体液免疫途径是imd途径。同时在肠道侵染试验中两个免疫途径突变体间的死亡率差距缩小趋于一致，可能暗示在这种侵染模式中，Serratia nematodiphila R186存在某种对免疫系统的逃逸机制或其通过释放的毒素蛋白这样与宿主对细菌免疫无关的方式杀死侵染对象。
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关键字:病原线虫共生菌；果蝇；体液免疫
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words: 3
引言 4
1 实验材料与方法 5
1．2．1果蝇培养与扩繁 6
1．2．2 共生菌对果蝇肠道侵染的实验 6
1．2．2. 1 共生菌对果蝇的肠道侵染 6
1．2．2. 2 肠道侵染的致死率和菌落cfu统计 6
1．2．3 共生菌对果蝇血腔侵染的实验 6
1．2．3. 1 共生菌对果蝇的血腔侵染 6
1．2．3. 2 肠道侵染的致死率和菌落cfu统计 6
1．2．3. 3 RNA提取与荧光定量试验 6
2 结果与分析 7
2．1 昆虫病原线虫共生菌R186对野生型果蝇的血腔侵染与肠道侵染实验 7
2．2 昆虫病原线虫共生菌R186对体液免疫突变体果蝇的血腔侵染 8
2．3 昆虫病原线虫共生菌R186对体液免疫突变体果蝇的肠道侵染 9
3 讨论 10
3．1 共生菌Serratia nematodiphila R186对侵染昆虫具有致死能力。在Heterorhabditidoides-Serratia共生体中起主要杀虫作用。 10
3．2 体液免疫中，imd途径在在抵抗共生菌Serratia nematodiphila中起主要作用。 11
致谢 11
参考文献： 12
附录 13
昆虫病原线虫共生菌Serratia nematodiphila R186与黑腹果蝇体液免疫系统的互作研究
引言
引言
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
/> 绿色农业是目前的农业发展趋势和整个社会对农产品的要求。实现绿色农业的一大瓶颈在于用无公害方法实现对于害虫的有效控制。毒性低、残留少、降解容易、对环境无不良影响的生物农药的研究受到关注，新型生物杀虫剂有望成为控制作物虫害、保障食品安全的根本途径之一[1,2]。
在昆虫体内存在具有抗病原微生物的先天性免疫系统。其中体液免疫存在2种病原体识别信号通路：Imd 途径和Toll途径[18,19]（图1）。Imd途径对革兰氏阴性菌敏感。Imd途径的重要组成部分有PGRP-LC脂多糖识别受体[20]，dFADD受体[21]，PREDD半胱天冬酶[22]，Relish转录因子[23]等。这些因子发生突变将会造成类似与imd缺陷的效果。抗菌肽中，Diptericin的表达依赖于Imd途径。本实验选用该途径的具有代表性的PGRP-LC，PREDD，Relish突变体进行试验。Toll途径对真菌和革兰氏阳性菌敏感。Toll途径上的Dif位点主要功能为激活抗菌肽Drosomycin 的表达[18,19]。Heterorhabditidoides 类昆虫病原线虫共生菌 Serratia nematodiphila 为革兰氏阴性菌。Aymeric[23]等的研究发现Photorhabdus luminescens 和 Xenorhabdus nematophila 是通过避开果蝇的imd免疫途径发挥其败血毒性从而杀死宿主昆虫的。Nadine[24]等的研究证实了昆虫病原菌可以通过肠道侵染致死果蝇，并提供了一些试验方法。这些相关的基础研究为本研究提供了理论基础与方法参考。
本研究通过肠道侵染与血腔侵染，分析Serratia nematodiphila与黑腹果蝇的体液免疫的互作机制。为深入研究Heterorhabditidoides-Serratia 类昆虫病原线虫共生体的杀虫机理提供参考，为这一共生体在生物防治中的实际应用提供理论依据。
图1 Drosophila 体液免疫的Toll 和IMD 信号通路[8,]
Fig. 1 Toll and IMD singling pathway of hormone immunity in Drosophila
1 实验材料与方法
1．1 实验材料
1．1．2 实验试剂及用品 酵母提取物、胰蛋白胨、氯化钠、琼脂粉、氨苄青霉素、Trizol、无水乙醇、氯仿、异丙醇、乙醚、蔗糖、玉米粉、酵母粉、丙酸、琼脂条、琼脂糖、DEPC、反转录试剂盒BioTeke supermoⅢ RT Kit（百泰克公司）、PCR试剂盒、荧光定量试剂UltraSYBR Mixture（With ROX）（康为世纪公司）、滤纸、钨针、放大镜。
1．1．3 实验仪器 智能人工气候箱（PRX-450B，宁波海曙赛福实验仪器厂）、恒温培养箱（PSX-280H型恒温恒湿培养箱，浙江宁波莱福）、 ABI7500荧光定量PCR仪、普通PCR仪、 高速冷冻离心机（Eppendorf）、电子天平（AR2130，OHAVS，Ohavs Corp.Pine Brook，NJ，USA）、高压灭菌锅、摇床、超低温冰箱、超净工作台。
1．2 实验方法
1．2．1果蝇培养与扩繁
以实验室购买并保存的野生型和PG *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
RP-LC，PREDD，Relish和Dif突变体黑腹果蝇为种蝇。在经过灭菌处理的果蝇培养指管中注入约1厘米高的无菌果蝇培养基，在管身用记号笔注明该管培养的果蝇类型及接种时间。每只培养指管放入十只左右性别大致对等的与管身标记对应的野生型或突变体种蝇，以灭菌棉塞塞住管口以防止果蝇逃逸及外界杂菌污染并保证空气流通。将接种好的培养管放入果蝇培养箱培养，培养的温度为25℃，湿度75%，光照2000lx，光照周期12小时。待培养基中出现大量肉眼可见的果蝇幼虫时，即可将管中成虫转移至新的培养管。依此重复，直至培养数量可满足实验要求为止。
1．2．2 共生菌对果蝇肠道侵染的实验
1．2．2. 1 共生菌对果蝇的肠道侵染
用保存的R187菌种划线，37℃培养12小时后，取单菌落接入LB液体培养基至于震荡摇床，37℃，200rpm/min 振荡培养24小时。将发酵的菌液以5000rpm离心10min，用无菌水清洗菌体沉淀，并用50mM蔗糖水将菌体重新悬浮，调整OD600为0.1。
将滤纸折叠后放入果蝇培养管底部，加上棉塞后，进行高压灭菌，灭菌后烘干，使滤纸片干燥。将50mM蔗糖水菌悬液1ml加入到滤纸片上，从进行实验的野生型或突变体果蝇中选取孵化6-7天的雌性个体15只用乙醚麻醉后转移到该种果蝇培养管中。至于培养箱中培养。本实验以相同处理得到的OD值相同的E.coli菌悬液处理的果蝇作为对照，每个实验至少进行3组重复。
1．2．2. 2 肠道侵染的致死率和菌落cfu统计
每12小时观察接受实验的野生型，imd途径PGRP-LC，PREDD，Relish突变体和Toll途径Dif突变体黑腹果蝇的存活率情况，记录数据。每24小时取尚幸存果蝇，麻醉后用医用酒精淋洗除去体表细菌，切除腹部，取头胸部研磨，匀浆梯度稀释涂布氨苄平板观察菌落生长情况，每个梯度实验至少进行3组重复。
由昆虫病原线虫共生菌单独造成的的肠道侵染与血腔侵染都可导致受试果蝇的死亡，而非果蝇病原菌的大肠杆菌在两种侵染条件下对果蝇的生存没有显著影响(图2)。比较不同侵染方式的结果可以发现，共生菌R186肠道侵染的致死速率要远远慢于血腔侵染。可能的原因是在在肠道侵染模式下共生菌及其产生的杀虫毒素需要穿透果蝇肠道壁才能进入血腔，从而延缓了共生菌致死的速度。
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