mir210的靶基因鉴定与分析
HEK293T细胞中的Ago2蛋白中包含多种miRNA（其中包括miR-210）。本课题旨在寻找能与Ago2蛋白中的miR-210结合的mRNA，此即为miR-210的靶序列。通过pIRESneo-FLAG-HA-Ago2质粒使得293T细胞过表达FLAG-HA-Ago2蛋白。将pIRESneo-FLAG-HA-Ago2质粒与miR-210、pIRESneo-FLAG-HA-Ago2质粒与对照RNA分别转染入293T细胞，转染完成后，通过Western blotting法测定细胞中的Ago2含量，通过RT-qPCR法测定细胞中的miR-210含量，证明Ago2和miR-210过表达。然后分离Ago2蛋白，提取其中的RNA进行测序，并利用电脑对测序结果进行分析，从而确定miR-210的靶序列，利于进一步探究miR-210的功能和作用原理。本实验找到一种条件能够在293T细胞中过表达FLAG-HA-Ago2蛋白和miR-210 RNA，并且能够分离提取FLAG-HA-Ago2和miR-210的复合物。今后的工作是研究这种复合物中mRNA的表达，从而鉴定miR-210的靶基因。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验材料2
1.1.1 HEK293细胞和HEK293T细胞（生工）2
1.1.2 pIRESneoFLAGHAAgo2质粒2
1.2 实验方法2
1.2.1 细胞传代2
1.2.2 细胞转染2
1.2.3 免疫共沉淀（CoIP）2
1.2.4 Western blotting3
1.2.5 RNA提取3
1.2.6 RTqPCR3
1.2.7 RNA测序数据分析3
2 结果与分析3
2.1 HEK293T细胞形态观察4
2.2 Western blotting4
2.3 RTqPCR扩增cDNA的表达量5
3 讨论5
致谢7
参考文献8
图1 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
未贴壁时的细胞和贴壁后的细胞的形态4
图2 Western blotting结果图4
图3 RTqPCR扩增cDNA的表达量5
miR210的靶基因鉴定与分析
引言
miRNA是一种长约为18~25nt的内源性小分子非编码RNA，其自身结构中没有开放阅读框，因而无法进行蛋白质的编码。miRNA是由一小段包含近似于发夹状结构、长约70~80nt的单链RNA前体经过Dicer酶的剪切加工作用后形成。在大多数动物体内，miRNA分子能够与目标靶基因mRNA分子的3UTR区域互补配对，阻遏mRNA分子的翻译过程或造成其降解，从而对靶基因翻译后的蛋白质表达水平表现为负调控[1]。而miRNA自身与目标靶基因的关系也并非是一一对应的，即某一miRNA分子可以调控多种靶基因的蛋白质表达水平，而某一靶基因的3UTR区域也可以与不同的miRNA分子配对结合，由此可以推断某一靶基因的蛋白质表达水平是多种miRNA分子共同发挥调控作用的总和。
同一个miRNA能够调控多个不同的mRNA，而不同的miRNA也能够对同一类mRNA起调控作用。有预测数据表明，人类细胞中约有1/3能够编码蛋白质的基因都受到miRNA分子的调控。miRNA分子在其表达过程中，表现时序性、进化过程中高度保守性及组织特异性等特征[2]。研究发现它在一定程度上能够调控细胞增殖分化及凋亡、细胞进化、胚胎发育、血管形成、肿瘤发生等很多生理及病理的基本过程。
miR210的位置处于人类第11号染色体上，其表达产物存在于各种细胞中。近几年有研究结果表明，miR210在缺血低氧性损伤、线粒体的呼吸作用、新生血管形成、肿瘤发生等过程中都能够发挥一定作用[3]。miR210表达上调与多种肿瘤的不良预后有关，例如胃癌、肺癌、肾癌及乳腺癌，且miR210在肿瘤中的过表达是微环境处于低氧状态的直接结果[49]。所以，对miR210展开全面研究可能有利于疾病诊断，以及缺血性相关疾病和肿瘤的治疗。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 HEK293细胞和HEK293T细胞（生工）
HEK293细胞是一种转染了腺病毒E1A基因的人体肾脏上皮细胞系，而HEK293T细胞则是由HEK293细胞派生而出，同时表达SV40大T抗原、含有SV40复制起始点和启动子区的质粒可以进行复制，蛋白表达水平高，有利于高效率转染的便携载体[10]。
1.1.2 pIRESneoFLAGHAAgo2质粒
Argonaute(Ago)蛋白广泛存在于各种生物体内，是一类相对分子质量大约为105的的碱性蛋白家族，且具有高度保守的结构。这个蛋白家族中，只有Ago2蛋白是RNA诱导沉默复合体(RISC)的重要成分，具有核酸内切酶活性，可以通过与miRNA相结合而调节成熟miRNAs的活性，参与mRNA的基因沉默过程，进而影响细胞的一系列生物学活性[11]。293T细胞瞬时转染pIRESneoFLAGHAAgo2后能过表达Ago2蛋白。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞传代
待细胞融合程度达到90%以上后，进行细胞传代。用移液枪吸走所有培养基，加入1ml含有10% FBS的新鲜高糖DMEM培养基洗涤细胞后弃去培养基，再加1ml 0.05%胰酶消化细胞，在显微镜下观察细胞开始变圆，有少量细胞开始脱离培养皿底部时，向培养皿中加入14ml含有FBS的新鲜高糖DMEM培养基将皿底细胞全部洗下，吹吸混匀后向6孔板的每个孔中转移2ml细胞悬液。培养皿中剩余2ml细胞悬液，补加10ml新鲜培养基并混匀后，放入37℃、5% CO2恒温培养箱中继续培养[12]。
1.2.2 细胞转染
在6孔板中进行细胞转染，共设置3种处理，分别标记为0组、1组和2组。0组作阴性对照，1组将pIRESneoFLAGHAAgo2质粒与对照RNA（NC）各1μg共转染入293T细胞，2组将pIRESneoFLAGHAAgo2质粒与miR210各1μg共转染入293T细胞[13]。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验材料2
1.1.1 HEK293细胞和HEK293T细胞（生工）2
1.1.2 pIRESneoFLAGHAAgo2质粒2
1.2 实验方法2
1.2.1 细胞传代2
1.2.2 细胞转染2
1.2.3 免疫共沉淀（CoIP）2
1.2.4 Western blotting3
1.2.5 RNA提取3
1.2.6 RTqPCR3
1.2.7 RNA测序数据分析3
2 结果与分析3
2.1 HEK293T细胞形态观察4
2.2 Western blotting4
2.3 RTqPCR扩增cDNA的表达量5
3 讨论5
致谢7
参考文献8
图1 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
未贴壁时的细胞和贴壁后的细胞的形态4
图2 Western blotting结果图4
图3 RTqPCR扩增cDNA的表达量5
miR210的靶基因鉴定与分析
引言
miRNA是一种长约为18~25nt的内源性小分子非编码RNA，其自身结构中没有开放阅读框，因而无法进行蛋白质的编码。miRNA是由一小段包含近似于发夹状结构、长约70~80nt的单链RNA前体经过Dicer酶的剪切加工作用后形成。在大多数动物体内，miRNA分子能够与目标靶基因mRNA分子的3UTR区域互补配对，阻遏mRNA分子的翻译过程或造成其降解，从而对靶基因翻译后的蛋白质表达水平表现为负调控[1]。而miRNA自身与目标靶基因的关系也并非是一一对应的，即某一miRNA分子可以调控多种靶基因的蛋白质表达水平，而某一靶基因的3UTR区域也可以与不同的miRNA分子配对结合，由此可以推断某一靶基因的蛋白质表达水平是多种miRNA分子共同发挥调控作用的总和。
同一个miRNA能够调控多个不同的mRNA，而不同的miRNA也能够对同一类mRNA起调控作用。有预测数据表明，人类细胞中约有1/3能够编码蛋白质的基因都受到miRNA分子的调控。miRNA分子在其表达过程中，表现时序性、进化过程中高度保守性及组织特异性等特征[2]。研究发现它在一定程度上能够调控细胞增殖分化及凋亡、细胞进化、胚胎发育、血管形成、肿瘤发生等很多生理及病理的基本过程。
miR210的位置处于人类第11号染色体上，其表达产物存在于各种细胞中。近几年有研究结果表明，miR210在缺血低氧性损伤、线粒体的呼吸作用、新生血管形成、肿瘤发生等过程中都能够发挥一定作用[3]。miR210表达上调与多种肿瘤的不良预后有关，例如胃癌、肺癌、肾癌及乳腺癌，且miR210在肿瘤中的过表达是微环境处于低氧状态的直接结果[49]。所以，对miR210展开全面研究可能有利于疾病诊断，以及缺血性相关疾病和肿瘤的治疗。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 HEK293细胞和HEK293T细胞（生工）
HEK293细胞是一种转染了腺病毒E1A基因的人体肾脏上皮细胞系，而HEK293T细胞则是由HEK293细胞派生而出，同时表达SV40大T抗原、含有SV40复制起始点和启动子区的质粒可以进行复制，蛋白表达水平高，有利于高效率转染的便携载体[10]。
1.1.2 pIRESneoFLAGHAAgo2质粒
Argonaute(Ago)蛋白广泛存在于各种生物体内，是一类相对分子质量大约为105的的碱性蛋白家族，且具有高度保守的结构。这个蛋白家族中，只有Ago2蛋白是RNA诱导沉默复合体(RISC)的重要成分，具有核酸内切酶活性，可以通过与miRNA相结合而调节成熟miRNAs的活性，参与mRNA的基因沉默过程，进而影响细胞的一系列生物学活性[11]。293T细胞瞬时转染pIRESneoFLAGHAAgo2后能过表达Ago2蛋白。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞传代
待细胞融合程度达到90%以上后，进行细胞传代。用移液枪吸走所有培养基，加入1ml含有10% FBS的新鲜高糖DMEM培养基洗涤细胞后弃去培养基，再加1ml 0.05%胰酶消化细胞，在显微镜下观察细胞开始变圆，有少量细胞开始脱离培养皿底部时，向培养皿中加入14ml含有FBS的新鲜高糖DMEM培养基将皿底细胞全部洗下，吹吸混匀后向6孔板的每个孔中转移2ml细胞悬液。培养皿中剩余2ml细胞悬液，补加10ml新鲜培养基并混匀后，放入37℃、5% CO2恒温培养箱中继续培养[12]。
1.2.2 细胞转染
在6孔板中进行细胞转染，共设置3种处理，分别标记为0组、1组和2组。0组作阴性对照，1组将pIRESneoFLAGHAAgo2质粒与对照RNA（NC）各1μg共转染入293T细胞，2组将pIRESneoFLAGHAAgo2质粒与miR210各1μg共转染入293T细胞[13]。
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