茶树半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatin的基因克隆及其表达载体的构建
：本实验目的是构建茶树半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的表达载体。以绿茶嫩芽中提取的总RNA为原料，以NCBI中比对所得的基因序列为模板设计上下游引物，通过RT-PCR获得完整的双链cDNA并将其克隆到pET-32a载体上，将连接产物导入大肠杆菌DE-3后进行抗生素筛选，对生长的菌落进行菌落PCR鉴定。菌落PCR鉴定结果为阳性，证明目的基因成功连接到表达载体上。本实验并未涉及茶树半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的诱导表达，但为进一步研究茶树半胱氨酸蛋白酶抑制剂的调控机制与功能提供了实验基础。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1实验材料、试剂 2
1.2实验方法 2
1.2.1 绿茶嫩芽总RNA 的获得 2
1.2.2 RNA的逆转录 3
1.2.3 双链cDNA的获得 3
1.2.4 PCR产物的纯化 4
1.2.5 pUCT重组质粒的构建 5
1.2.6 DH5α感受态细胞的制备 5
1.2.7 DH5α的转化 5
1.2.8 pUCT重组质粒的鉴定 6
1.2.9 pUCT重组质粒的提取 6
1.2.10 pET32a质粒的提取 7
1.2.11 pUCT重组质粒、pET32a质粒的双酶切 8
1.2.12 pET32a重组质粒的构建 8
1.2.13 DH5α感受态细胞的制备 8
1.2.14 DH5α的转化 8
1.2.15 pET32a重组质粒的鉴定 8
1.2.16 pET32a重组质粒的提取 9
1.2.17 DE3感受态细胞的制备 9
1.2.18 DE3的转化 9
1.2.19 DE3转化结果的鉴定 9
2 结果与分析 9
2.1 绿茶嫩芽总RNA 1%琼脂糖凝胶电泳 9
2.2 二轮PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳 10
2.3 pUCT重组质粒1%琼
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
脂糖凝胶电泳结果 10
2.4 pUCT重组质粒及pET32a质粒双酶切电泳结果 11
2.4.1 Kpn I单酶切 11
2.4.2 BamH I单酶切 11
2.5 DH5α菌落PCR 1%琼脂糖凝胶电泳结果 12
2.6 DE3菌落PCR 1%琼脂糖凝胶电泳结果 13
2.7 pET32a重组质粒双酶切电泳结果 13
3 讨论 14
致谢 14
参考文献 15
茶树半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatin的基因克隆及其表达载体的构建
引言
引言
茶叶作为我国的一种传统饮品，其卓越的保健功能一直为大家所喜爱。近年来，人们对茶叶的研究越来越多，但主要集中在茶叶的宏观研究，比如如何提高茶叶的品质与质量以及茶叶内含物茶多酚和茶多糖方面[1]，对茶叶中的蛋白质，特别是半胱氨酸蛋白酶抑制剂研究很少。本课题所要做的就是从茶叶嫩芽中提取出总RNA，通过RTPCR获得目的基因，并构建表达载体，便于为后来的功能研究提供助力。
半胱氨酸蛋白酶抑制剂是一种能在内部切割多肽的硫醇蛋白酶，它的活性位点上存在一对二硫键，其含有3个高度保守的序列，可以构成一个楔形结构来阻碍半胱氨酸蛋白酶活性位点[2]。半胱氨酸蛋白酶广泛存在于自然界中，其一般存在于溶酶体内，参与细胞吞噬和细胞多余物质的清除、消化。半胱氨酸蛋白酶抑制剂是一种可逆的、竞争性的抑制剂，能与其靶酶半胱氨酸蛋白酶结合形成一个等摩尔数的紧密复合物，从而封闭靶酶的活性中心而起到抑制作用[35]，广泛存在于动植物组织和体液中，保护蛋白质的二硫键免受半胱氨酸蛋白酶的破坏，从而能防止蛋白降解。目前主要研究人、鼠半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，豆类植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂以及寄生线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂。其中，cystatin C是研究的最多的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，它参与了肿瘤入侵与转移、炎症和一些神经性疾病方面。很多寄生虫体内也含有半胱氨酸蛋白酶及其抑制剂，这些蛋白酶抑制剂可以很好地抑制宿主体内的半胱氨酸蛋白酶，以利于寄生虫更好地侵入宿主体内摄取营养和繁殖[6,7]。
Cystatin主要分为三个家族：①Stefins家族：这类家族主要成员为StefinsA和StefinsB。它们是非糖基化的一类抑制剂，大小在11KDa左右，缺乏信号序列和二硫键，一般在胞内表达。这类分子主要分布在上皮细胞和多核白细胞内，家族成员之间具有广泛的序列相似性和一致性。②Cystatins家族：其成员大多为分泌蛋白，大小在1314KDa，多肽链的羧基端含有信号肽序列和二硫键。家族中的一些成员为糖基化的[8,9]，主要包括鸡cystatin及cystatinC,D,S,SA和SN等，广泛分布于各种生物体液中。③Kininogens家族：主要存在于血浆和分泌液中。分子量为88114KDa，分子为糖基化的，含有3个cystatins家族结构域，其中两个（结构域2和3）有酶抑制剂活性。除此之外，目前还发现了一些含有半胱氨酸蛋白酶抑制剂功能区域但缺乏酶抑制剂活性的蛋白，如组氨酸糖蛋白、cystatin相关蛋白等，这些蛋白连同上述三个类型共同构成cystatin超家族。
半胱氨酸蛋白酶抑制剂在自然界具有广泛作用，这里主要描述半胱氨酸蛋白酶抑制剂在肿瘤发生、肾小球滤过率、免疫调节方面的部分作用。①Cystatins在肿瘤发生中的作用：半胱氨酸蛋白酶中的组织蛋白酶B能分解胞外基质蛋白来使细胞移动，而组织蛋白酶B的活性能被Cystatin C抑制[10]。②一直以来，血清肌酐都用来作为对肾功能鉴定（glomerular filtration rate, GFR）的基准标示物[11,12]。GFR的理想标志物的要求有：不受个体差异因素影响，在体内以恒定比例产生，由肾脏过滤和排除，不经肾小管分泌和重吸收，在尿液中以稳定形式存在，而Cyst C符合上述大多数要求而成为GFR的很合适的基准标示物，Simonsen[13]发现与GFR外源标示物相比Cyst C的分泌与GFR有很好的相关性。Cyst C 在血液、唾液、精液、关节滑液和脑脊液中浓度很高，很容易被肾小球过滤并在大多数有核细胞中以恒定比率产生和分泌。③FetuinA和它的人源同源物ahsg均属于半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员，在正常的循环中含量为0.5mg/ml，在受伤或感染的情况下则急剧下降（下降约40%）。这些半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员作为免疫调节剂可调节中性粒细胞的噬菌作用和促进小鼠巨噬细胞内吞作用[14,15]。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1实验材料、试剂 2
1.2实验方法 2
1.2.1 绿茶嫩芽总RNA 的获得 2
1.2.2 RNA的逆转录 3
1.2.3 双链cDNA的获得 3
1.2.4 PCR产物的纯化 4
1.2.5 pUCT重组质粒的构建 5
1.2.6 DH5α感受态细胞的制备 5
1.2.7 DH5α的转化 5
1.2.8 pUCT重组质粒的鉴定 6
1.2.9 pUCT重组质粒的提取 6
1.2.10 pET32a质粒的提取 7
1.2.11 pUCT重组质粒、pET32a质粒的双酶切 8
1.2.12 pET32a重组质粒的构建 8
1.2.13 DH5α感受态细胞的制备 8
1.2.14 DH5α的转化 8
1.2.15 pET32a重组质粒的鉴定 8
1.2.16 pET32a重组质粒的提取 9
1.2.17 DE3感受态细胞的制备 9
1.2.18 DE3的转化 9
1.2.19 DE3转化结果的鉴定 9
2 结果与分析 9
2.1 绿茶嫩芽总RNA 1%琼脂糖凝胶电泳 9
2.2 二轮PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳 10
2.3 pUCT重组质粒1%琼
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
脂糖凝胶电泳结果 10
2.4 pUCT重组质粒及pET32a质粒双酶切电泳结果 11
2.4.1 Kpn I单酶切 11
2.4.2 BamH I单酶切 11
2.5 DH5α菌落PCR 1%琼脂糖凝胶电泳结果 12
2.6 DE3菌落PCR 1%琼脂糖凝胶电泳结果 13
2.7 pET32a重组质粒双酶切电泳结果 13
3 讨论 14
致谢 14
参考文献 15
茶树半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatin的基因克隆及其表达载体的构建
引言
引言
茶叶作为我国的一种传统饮品，其卓越的保健功能一直为大家所喜爱。近年来，人们对茶叶的研究越来越多，但主要集中在茶叶的宏观研究，比如如何提高茶叶的品质与质量以及茶叶内含物茶多酚和茶多糖方面[1]，对茶叶中的蛋白质，特别是半胱氨酸蛋白酶抑制剂研究很少。本课题所要做的就是从茶叶嫩芽中提取出总RNA，通过RTPCR获得目的基因，并构建表达载体，便于为后来的功能研究提供助力。
半胱氨酸蛋白酶抑制剂是一种能在内部切割多肽的硫醇蛋白酶，它的活性位点上存在一对二硫键，其含有3个高度保守的序列，可以构成一个楔形结构来阻碍半胱氨酸蛋白酶活性位点[2]。半胱氨酸蛋白酶广泛存在于自然界中，其一般存在于溶酶体内，参与细胞吞噬和细胞多余物质的清除、消化。半胱氨酸蛋白酶抑制剂是一种可逆的、竞争性的抑制剂，能与其靶酶半胱氨酸蛋白酶结合形成一个等摩尔数的紧密复合物，从而封闭靶酶的活性中心而起到抑制作用[35]，广泛存在于动植物组织和体液中，保护蛋白质的二硫键免受半胱氨酸蛋白酶的破坏，从而能防止蛋白降解。目前主要研究人、鼠半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，豆类植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂以及寄生线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂。其中，cystatin C是研究的最多的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，它参与了肿瘤入侵与转移、炎症和一些神经性疾病方面。很多寄生虫体内也含有半胱氨酸蛋白酶及其抑制剂，这些蛋白酶抑制剂可以很好地抑制宿主体内的半胱氨酸蛋白酶，以利于寄生虫更好地侵入宿主体内摄取营养和繁殖[6,7]。
Cystatin主要分为三个家族：①Stefins家族：这类家族主要成员为StefinsA和StefinsB。它们是非糖基化的一类抑制剂，大小在11KDa左右，缺乏信号序列和二硫键，一般在胞内表达。这类分子主要分布在上皮细胞和多核白细胞内，家族成员之间具有广泛的序列相似性和一致性。②Cystatins家族：其成员大多为分泌蛋白，大小在1314KDa，多肽链的羧基端含有信号肽序列和二硫键。家族中的一些成员为糖基化的[8,9]，主要包括鸡cystatin及cystatinC,D,S,SA和SN等，广泛分布于各种生物体液中。③Kininogens家族：主要存在于血浆和分泌液中。分子量为88114KDa，分子为糖基化的，含有3个cystatins家族结构域，其中两个（结构域2和3）有酶抑制剂活性。除此之外，目前还发现了一些含有半胱氨酸蛋白酶抑制剂功能区域但缺乏酶抑制剂活性的蛋白，如组氨酸糖蛋白、cystatin相关蛋白等，这些蛋白连同上述三个类型共同构成cystatin超家族。
半胱氨酸蛋白酶抑制剂在自然界具有广泛作用，这里主要描述半胱氨酸蛋白酶抑制剂在肿瘤发生、肾小球滤过率、免疫调节方面的部分作用。①Cystatins在肿瘤发生中的作用：半胱氨酸蛋白酶中的组织蛋白酶B能分解胞外基质蛋白来使细胞移动，而组织蛋白酶B的活性能被Cystatin C抑制[10]。②一直以来，血清肌酐都用来作为对肾功能鉴定（glomerular filtration rate, GFR）的基准标示物[11,12]。GFR的理想标志物的要求有：不受个体差异因素影响，在体内以恒定比例产生，由肾脏过滤和排除，不经肾小管分泌和重吸收，在尿液中以稳定形式存在，而Cyst C符合上述大多数要求而成为GFR的很合适的基准标示物，Simonsen[13]发现与GFR外源标示物相比Cyst C的分泌与GFR有很好的相关性。Cyst C 在血液、唾液、精液、关节滑液和脑脊液中浓度很高，很容易被肾小球过滤并在大多数有核细胞中以恒定比率产生和分泌。③FetuinA和它的人源同源物ahsg均属于半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员，在正常的循环中含量为0.5mg/ml，在受伤或感染的情况下则急剧下降（下降约40%）。这些半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员作为免疫调节剂可调节中性粒细胞的噬菌作用和促进小鼠巨噬细胞内吞作用[14,15]。
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