id1蛋白抑制剂哌咪清（pimozide）在复发难治b细胞淋巴瘤治疗中的作用与机制研究id1蛋白抑制剂哌咪清（pimozide）在复发难治b细胞淋巴瘤治疗中的作用与机制研究【字数：11453】
淋巴瘤是一种淋巴细胞来源的实体肿瘤，分为霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤两大类。侵袭性B细胞非霍奇金淋巴瘤中最常见的是弥漫性大B细胞淋巴瘤。研究发现淋巴瘤病人高表达ID1蛋白。ID1蛋白属于螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix，HLH)转录因子家族，但不含DNA结合结构域。本课题使用能够下调ID1蛋白的抑制剂哌咪清（Pimozide）在淋巴瘤细胞中去研究ID1蛋白低表达在B细胞淋巴瘤中的作用与机制。实验结果表明哌咪清对Raji和Raji-4RH的增殖都有抑制作用，并且可以诱导Raji的凋亡，还可以影响Raji和Raji-4RH的细胞周期。Pimozide与阿霉素和依托泊苷具有协同效应，表明ID1低表达可以提高细胞对这两种化疗药物的敏感性。而Pimozide与顺铂和盐酸吉西他滨具有拮抗效应，表明ID1低表达不能提高细胞对这两种化疗药物的敏感性。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言3
1材料与方法4
1.1实验材料与仪器 4
1.1.1实验材料4
1.1.2仪器设备4
1.2实验方法 4
1.2.1慢病毒质粒构建4
1.2.2 慢病毒质粒转化、培养及抽提5
1.2.3 293T、Raji和Raji4RH的复苏、培养和传代6
1.2.4 转染293T——磷酸钙法6
1.2.5 感染Raji4RH建立稳定细胞系7
1.2.6 蛋白质免疫印迹实验（Western Blot）7
1.2.7 细胞增殖实验9
1.2.8 检测哌咪清对Raji和Raji4RH的生长抑制作用9
1.2.9 流式细胞术检测细胞凋亡9
1.2.10流式细胞术检测细胞周期9
1.2.11检测哌咪清与四种化疗药物的相互作用9
2结果与分析9
2.1哌咪清对Raji和Raji4RH的生长抑制实验结果9
2.2细胞凋亡及细胞周期实验结果10
2.3哌咪清与四种化疗药物相互作用实验结果11
2.4293T *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
转染结果——荧光观察13
3讨论14
致谢15
参考文献16
ID1蛋白抑制剂哌咪清（Pimozide）在复发难治B细胞淋巴瘤治疗中的作用与机制研究
国家理科基础科学研究与教学人才培养基地班学生 刘智超
引言
淋巴瘤是原发于淋巴细胞、淋巴结等淋巴造血系统的恶性肿瘤。由于其分型众多，且在形态、病理特征等方面具有很高的异质性，淋巴瘤的分类经历了一系列的变化，并且在不断更新。2016年，WHO发布了最新版淋巴瘤分类[1]。其中，淋巴瘤主要分为两大类：霍奇金淋巴瘤（hodgkin’s lymphoma,HL）和非霍奇金淋巴瘤（nonhodgkin’s lymphoma, NHL）。HL分型相对较少，而NHL分型非常多。在NHL中按照恶性程度可分为低度、中度和高度恶性淋巴瘤；按照细胞来源可分为成熟T细胞淋巴瘤、成熟NK细胞瘤和成熟B细胞淋巴瘤。其中B细胞淋巴瘤占比最大。
B细胞淋巴瘤是发源于B细胞的实体肿瘤。其中占比更高的B细胞非霍奇金淋巴瘤最常见的几种分型包括：小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤等，这些分型约占B细胞非霍奇金淋巴瘤的3/4[23]。B细胞霍奇金淋巴瘤分型包括：经典霍奇金淋巴瘤和结节性淋巴细胞。在我国，非霍奇金淋巴瘤患病率远高于霍奇金淋巴瘤，且非霍奇金淋巴瘤的病理特征、临床症状和治疗远复杂于霍奇金淋巴瘤，因此总的治愈率和预后也都不及霍奇金淋巴瘤。
在B细胞非霍奇金淋巴瘤中，弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large Bcell lymphoma，DLBCL）是最常见的病理类型。在我国 DLBCL占 B 细胞非霍奇金淋巴瘤的一半左右[4]，在其他国家约占三分之一。近年来，我国DLBCL的发病率仍在不断上升。经调查研究发现70%左右的DLBCL 患者经一线治疗能达到完全缓解[5]，其中约三分之一的 DLBCL 患者最终会复发，而10% 15% 的患者将发展为难治性DLBCL（recurrent refractory diffuse large Bcell lymphoma, rrDLBCL） [67]。在复发难治性 DLBCL 患者中，也只有三分之一左右的患者对二线治疗有反应[89]，且预后更差，2年生存率仅为 20%左右[10]。
近年来，靶向药物、免疫治疗的发展为rrDLBCL 的治疗不断提供新的方案。1997年，CD20单克隆抗体利妥昔（也称为美罗华）首次被批准用于治疗淋巴瘤，并且已表现出显著的疗效[1112]。利妥昔能特异性结合淋巴细胞上的 CD20抗原，通过介导补体和抗体依赖的细胞毒作用清除 B 细胞。另外，利妥昔还能抑制淋巴瘤细胞 Bcl2 的过度表达，并且直接诱导 B 淋巴细胞的凋亡，增加非霍奇金B淋巴瘤细胞对化疗药物的敏感性[13]。还有研究结果显示，利妥昔单抗对复发难治性非霍奇金淋巴瘤也有一定的效果[14]。但由于很多患者前期已经使用过利妥昔，因此会对其产生耐药性，在二线治疗时只有25%左右的患者产生应答，中位总生存期只有4个月，中位无进展生存期仅为3个月[1516]。因此寻找新的靶向治疗药物控制复发难治性B淋巴瘤，改善患者的预后，延长患者的生存期是目前临床亟需研究的难题。
通过免疫组织化学分析发现，淋巴瘤病人高表达ID1(inhibitor of binding 1)蛋白。ID蛋白是HLH蛋白家族的成员。分化抑制因子(inhibitors of differentiation，ID)，又称DNA结合抑制因子(inhibitors of DNA binding)，是螺旋环螺旋(helixloophelix，HLH)转录因子家族成员之一。ID蛋白家族共有4个成员，分别为ID1,ID2,ID3和ID4。目前已经发现多种蛋白质含有HLH高级结构，但是ID蛋白家族与其它HLH蛋白不同。因为ID蛋白家族不含有DNA结合结构域（basic DNA blinding domain）。因此ID蛋白又被称为显性负（dominantnegative） HLH蛋白。含有DNA结合结构域的HLH蛋白称为碱性HLH蛋白（basic helixloophelix, bHLH）。bHLH蛋白可以形成bHLHbHLH二聚体，并通过DNA结合结构域结合到染色质上的蛋白结合位点，通过这种方式调节下游基因的表达，从而实现对细胞命运的决定，对分化和增殖的控制。而在表达ID蛋白比较高的细胞中，会形成IDbHLH异二聚体，且比bHLHbHLH二聚体更多，由于ID 蛋白缺少结合到DNA 上的DNA结合结构域，使IDbHLH异二聚体不能结合到DNA上的蛋白结合位点，因此能阻遏bHLH所调控的下游基因的表达[1721]。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言3
1材料与方法4
1.1实验材料与仪器 4
1.1.1实验材料4
1.1.2仪器设备4
1.2实验方法 4
1.2.1慢病毒质粒构建4
1.2.2 慢病毒质粒转化、培养及抽提5
1.2.3 293T、Raji和Raji4RH的复苏、培养和传代6
1.2.4 转染293T——磷酸钙法6
1.2.5 感染Raji4RH建立稳定细胞系7
1.2.6 蛋白质免疫印迹实验（Western Blot）7
1.2.7 细胞增殖实验9
1.2.8 检测哌咪清对Raji和Raji4RH的生长抑制作用9
1.2.9 流式细胞术检测细胞凋亡9
1.2.10流式细胞术检测细胞周期9
1.2.11检测哌咪清与四种化疗药物的相互作用9
2结果与分析9
2.1哌咪清对Raji和Raji4RH的生长抑制实验结果9
2.2细胞凋亡及细胞周期实验结果10
2.3哌咪清与四种化疗药物相互作用实验结果11
2.4293T *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
转染结果——荧光观察13
3讨论14
致谢15
参考文献16
ID1蛋白抑制剂哌咪清（Pimozide）在复发难治B细胞淋巴瘤治疗中的作用与机制研究
国家理科基础科学研究与教学人才培养基地班学生 刘智超
引言
淋巴瘤是原发于淋巴细胞、淋巴结等淋巴造血系统的恶性肿瘤。由于其分型众多，且在形态、病理特征等方面具有很高的异质性，淋巴瘤的分类经历了一系列的变化，并且在不断更新。2016年，WHO发布了最新版淋巴瘤分类[1]。其中，淋巴瘤主要分为两大类：霍奇金淋巴瘤（hodgkin’s lymphoma,HL）和非霍奇金淋巴瘤（nonhodgkin’s lymphoma, NHL）。HL分型相对较少，而NHL分型非常多。在NHL中按照恶性程度可分为低度、中度和高度恶性淋巴瘤；按照细胞来源可分为成熟T细胞淋巴瘤、成熟NK细胞瘤和成熟B细胞淋巴瘤。其中B细胞淋巴瘤占比最大。
B细胞淋巴瘤是发源于B细胞的实体肿瘤。其中占比更高的B细胞非霍奇金淋巴瘤最常见的几种分型包括：小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤等，这些分型约占B细胞非霍奇金淋巴瘤的3/4[23]。B细胞霍奇金淋巴瘤分型包括：经典霍奇金淋巴瘤和结节性淋巴细胞。在我国，非霍奇金淋巴瘤患病率远高于霍奇金淋巴瘤，且非霍奇金淋巴瘤的病理特征、临床症状和治疗远复杂于霍奇金淋巴瘤，因此总的治愈率和预后也都不及霍奇金淋巴瘤。
在B细胞非霍奇金淋巴瘤中，弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large Bcell lymphoma，DLBCL）是最常见的病理类型。在我国 DLBCL占 B 细胞非霍奇金淋巴瘤的一半左右[4]，在其他国家约占三分之一。近年来，我国DLBCL的发病率仍在不断上升。经调查研究发现70%左右的DLBCL 患者经一线治疗能达到完全缓解[5]，其中约三分之一的 DLBCL 患者最终会复发，而10% 15% 的患者将发展为难治性DLBCL（recurrent refractory diffuse large Bcell lymphoma, rrDLBCL） [67]。在复发难治性 DLBCL 患者中，也只有三分之一左右的患者对二线治疗有反应[89]，且预后更差，2年生存率仅为 20%左右[10]。
近年来，靶向药物、免疫治疗的发展为rrDLBCL 的治疗不断提供新的方案。1997年，CD20单克隆抗体利妥昔（也称为美罗华）首次被批准用于治疗淋巴瘤，并且已表现出显著的疗效[1112]。利妥昔能特异性结合淋巴细胞上的 CD20抗原，通过介导补体和抗体依赖的细胞毒作用清除 B 细胞。另外，利妥昔还能抑制淋巴瘤细胞 Bcl2 的过度表达，并且直接诱导 B 淋巴细胞的凋亡，增加非霍奇金B淋巴瘤细胞对化疗药物的敏感性[13]。还有研究结果显示，利妥昔单抗对复发难治性非霍奇金淋巴瘤也有一定的效果[14]。但由于很多患者前期已经使用过利妥昔，因此会对其产生耐药性，在二线治疗时只有25%左右的患者产生应答，中位总生存期只有4个月，中位无进展生存期仅为3个月[1516]。因此寻找新的靶向治疗药物控制复发难治性B淋巴瘤，改善患者的预后，延长患者的生存期是目前临床亟需研究的难题。
通过免疫组织化学分析发现，淋巴瘤病人高表达ID1(inhibitor of binding 1)蛋白。ID蛋白是HLH蛋白家族的成员。分化抑制因子(inhibitors of differentiation，ID)，又称DNA结合抑制因子(inhibitors of DNA binding)，是螺旋环螺旋(helixloophelix，HLH)转录因子家族成员之一。ID蛋白家族共有4个成员，分别为ID1,ID2,ID3和ID4。目前已经发现多种蛋白质含有HLH高级结构，但是ID蛋白家族与其它HLH蛋白不同。因为ID蛋白家族不含有DNA结合结构域（basic DNA blinding domain）。因此ID蛋白又被称为显性负（dominantnegative） HLH蛋白。含有DNA结合结构域的HLH蛋白称为碱性HLH蛋白（basic helixloophelix, bHLH）。bHLH蛋白可以形成bHLHbHLH二聚体，并通过DNA结合结构域结合到染色质上的蛋白结合位点，通过这种方式调节下游基因的表达，从而实现对细胞命运的决定，对分化和增殖的控制。而在表达ID蛋白比较高的细胞中，会形成IDbHLH异二聚体，且比bHLHbHLH二聚体更多，由于ID 蛋白缺少结合到DNA 上的DNA结合结构域，使IDbHLH异二聚体不能结合到DNA上的蛋白结合位点，因此能阻遏bHLH所调控的下游基因的表达[1721]。
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