植物促生菌联合植物修复镉污染土壤研究
摘 要： 为了解决现在土壤重金属污染的问题，证明植物促生菌联合植物修复污染的设想。本实验从汤山矿区受重金属污染的土壤取样，筛选出抗Cu2+、Cd2+能力较强的细菌，并筛选出具有产生吲哚乙酸（IAA）和铁载体能力的菌株，研究发现这些物质能够帮助植物生长，增加土壤修复效率。盆栽试验发现，菌体产生的IAA能促进植株的生长，在没有重金属的情况下接了促生菌的情况下叶和根生物量分别增长了48.8%、30.7%，在重金属存在情况下依然有促进功效。在Cd浓度为5%条件下，细菌能使叶片中重金属减少36.9%，在10%的浓度时候能减少叶片中的重金属31.6%。在Cd浓度为5%条件下，细菌能够促进植物根吸收多10.0%的重金属，而在10%的Cd浓度下植株根部重金属吸收减少了3.9%。经DNA鉴定为肠杆菌属 (Enterobacter Hormaeche and Edwards,1960)
目录
摘 要 2
关键词 2
Abstract 2
Keywords 2
0．引言 2
1． 材料与方法 3
1.1细菌的初步筛选纯化 3
1.1.1采样 3
1.1.2 培养 3
1.1.3 初步筛选 4
1.2 IAA产量测定 4
1.3铁载体产量测定 4
1.4 细菌的复筛 4
1.4.1 摇瓶吸附实验 4
1.4.2 菌种的保藏 4
1.5 细菌种类鉴定 4
1.5.1 DNA的提取 5
1.5.2 电泳 5
1.5.3 细菌16srRNA的PCR扩增 5
1.5.4 16srRNA序列测定 5
1.6 盆栽试验 5
2． 数据与分析 6
2.1 IAA数据分析 6
2.2 CAS数据 8
2.3 摇瓶富集实验结果 10
2.3 盆栽试验数据 12
3． 总结与讨论 15
致谢 15
参考文献 15
植物促生菌联合植物修复镉污染土壤研究
引言
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
随着城市化工业化以及企业集约化进程的加快，土壤重金属污染已成为深受全球关注的环境问题之一。据报道，中国遭受不同程度重金属污染的耕地土壤面积接近2000万hm2，约占耕地土壤总面积的10%以上[1]。土壤中有相当一部分重金属是植物所必需的微量元素，而另有一些重金属则被视为环境污染物，研究较多的是镉(Cd)、铅(Pb)、铜(Cu)、锌(Zn)和汞( Hg)。[2] 土壤重金属污染可影响农作物产量和质量下降，并可通过食物链危害人类健康，慢慢地会导致大气和水体环境质量的进一步恶化。[3]
由于重金属在土壤中存在多种形态并且可以被改变。[4] 改变重金属元素在土壤中的存在形态，使其从活化态转变为稳定态单质从而降低毒性是一种解决方法。还有一种方法是用各种方法直接去除土壤中重金属，目前已经有各种不同手段的处理方法。其中物理方法是热处理技术、淋滤法、洗土法及施用调控剂法。[5] 利用化学的方法把土壤中重金属氧化、还原、沉淀、吸附、抑制和拮抗等，以降低重金属的生物有效性。[3] 研究表明，2 mol/L HCl可以去除污染土壤中55%的Fe，42% 的Cu，67% 的Zn，70% 的Mn，57% 的Pb。[6] 沈阳张士污灌区进行了大面积石灰改良实验表明，每公顷施石灰1500~1875 kg籽实含Cd量下降50% [7]，此类为化学方法。生物学手段更加多样，利用土壤中的某些低等动物蚯蚓、鼠类等吸收土壤中的重金属。细菌、放线菌对重金属更加敏感，格兰氏阳性菌可吸收Cd、Cu、Ni、Pb等重金属。[8] 植物方面的研究有印度芥菜（Brassica juncea）可对Cr、Cd、Ni、Zn、Cu富集分别能力分别为58，52，31，17，7倍。[9]高杆牧草（Agropyron elongatum）能吸收Cu等重金属。[10]化学与物理的方法多对环境有破坏，而生物的方法相比前者有成本低、无污染、无二次破坏、和更加自然化的优点。[11]植物修复技术的难题是如何对超积累植物或积累植物的筛选与保证植物的正常生长，其治理的效果取决于超积累植物或积累植物对重金属的吸收富集能力和其生物量[12]。
植物内生细菌(Entophyte)是指从表面消毒的植物组织中分离得到或从植物内部获得的能够定殖在健康植物各种组织和器官内，并未使植物的表型特征和功能发生改变的细菌。研究发现，分离自伯士隆庭荠的内生菌83%( 67株) 在镍胁迫下能分泌铁载体，并提高植物对镍、镉、钴、锌、铜等重金属毒性的抗性，从而促进植物在重金属胁迫土壤中生长。[13] 有些土壤细菌可以促进植物的健康生长，加强其根系的伸长和发展，或提高植物对逆境的耐受性这种细菌我们一般称之为植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)。[14]Zaidi et al认为植物根际促生菌所产的吲哚乙酸(Indole3acetic acid，IAA）能够促进植物的生长。[15] Hu和Boyer认为植物根际促生菌所产的铁载体能络合Fe3+，土壤中其他的重金属同时也能被溶出，植物能利用Fe3+和其他对生长有利的离子，使得植物更好生长。[16] 植物根际促生菌可以通过多种形式间接（通过促进植物生长发育）或直接（通过改变土壤中重金属的形态）影响植物对土壤中重金属的吸收。[14]本实验在分离纯化的众多微生物中，将其产生是否能产生IAA和其产量作为一个指标，将其产生的铁离子作为第二指标，经过一系列的测量和后期数据的处理，获得品质较好的细菌，然后再进过摇瓶吸附试验数据的筛选，获得能力最好的细菌对其进行保藏、鉴定后进行盆栽试验，以证明植物联合微生物修复土壤在实际变现中的可行性。
材料与方法
1.1细菌的初步筛选纯化
1.1.1采样
在汤山比较贫瘠（受重金属污染比较严重）的土地上寻找生长状态较好的植株，将小株的植株直接用铲子放进袋中，并在原本根的周围取一定量的土壤装入信封中，本实验取了两株植物和其周围的四份土样。
1.1.2 培养
准备6个洗干净的摇瓶，每个摇瓶中加入50mL的去离子水，放入玻璃珠子，其中四个称0.5g土样，尽量取小颗粒的，放入摇瓶中混匀。将两种植物的根、叶0.5g，用酒精洗净，在研钵中磨至匀浆，再放入摇瓶中摇匀。将每一个摇瓶中的菌悬液的浓度稀释至102、103、104。
富集培养：将培养基融化后把重金属浓度调至Cd2+各100mg/L，准备54块平板，每个浓度各涂三块。放入恒温箱中培养48h。
1.1.3 初步筛选
从培养基中选出一定菌落较大，长势较好的，用牙签环沾取少量，转移到新的已划好格子重金属平板上，培养48h，再在新的平板上去长势好，菌落丰满的菌移至新的重金属平板上富集培养，恒温箱培养48h，最后在挑出长势好菌落丰满的菌株，再另准备20个LB平板划线培养。一共取30个菌，编号L1L30。
1.2 IAA产量测定
配制有氮培养基，配制10mg/mL色氨酸溶液，准备试管，每根试管加3mL的有氮培养液150μL的配好的色氨酸溶液，灭菌，接入菌液200μL，培养72h。把培养好的菌液倒入5mL的离心管中8000rpm/min 5min，之后取上清1mL转入新的离心管中，再加50μL 10mmol/mL的正磷酸溶液，2mL 0.5mol/mL of reagen溶液，暗反应30min。530nm，测吸光度。
目录
摘 要 2
关键词 2
Abstract 2
Keywords 2
0．引言 2
1． 材料与方法 3
1.1细菌的初步筛选纯化 3
1.1.1采样 3
1.1.2 培养 3
1.1.3 初步筛选 4
1.2 IAA产量测定 4
1.3铁载体产量测定 4
1.4 细菌的复筛 4
1.4.1 摇瓶吸附实验 4
1.4.2 菌种的保藏 4
1.5 细菌种类鉴定 4
1.5.1 DNA的提取 5
1.5.2 电泳 5
1.5.3 细菌16srRNA的PCR扩增 5
1.5.4 16srRNA序列测定 5
1.6 盆栽试验 5
2． 数据与分析 6
2.1 IAA数据分析 6
2.2 CAS数据 8
2.3 摇瓶富集实验结果 10
2.3 盆栽试验数据 12
3． 总结与讨论 15
致谢 15
参考文献 15
植物促生菌联合植物修复镉污染土壤研究
引言
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
随着城市化工业化以及企业集约化进程的加快，土壤重金属污染已成为深受全球关注的环境问题之一。据报道，中国遭受不同程度重金属污染的耕地土壤面积接近2000万hm2，约占耕地土壤总面积的10%以上[1]。土壤中有相当一部分重金属是植物所必需的微量元素，而另有一些重金属则被视为环境污染物，研究较多的是镉(Cd)、铅(Pb)、铜(Cu)、锌(Zn)和汞( Hg)。[2] 土壤重金属污染可影响农作物产量和质量下降，并可通过食物链危害人类健康，慢慢地会导致大气和水体环境质量的进一步恶化。[3]
由于重金属在土壤中存在多种形态并且可以被改变。[4] 改变重金属元素在土壤中的存在形态，使其从活化态转变为稳定态单质从而降低毒性是一种解决方法。还有一种方法是用各种方法直接去除土壤中重金属，目前已经有各种不同手段的处理方法。其中物理方法是热处理技术、淋滤法、洗土法及施用调控剂法。[5] 利用化学的方法把土壤中重金属氧化、还原、沉淀、吸附、抑制和拮抗等，以降低重金属的生物有效性。[3] 研究表明，2 mol/L HCl可以去除污染土壤中55%的Fe，42% 的Cu，67% 的Zn，70% 的Mn，57% 的Pb。[6] 沈阳张士污灌区进行了大面积石灰改良实验表明，每公顷施石灰1500~1875 kg籽实含Cd量下降50% [7]，此类为化学方法。生物学手段更加多样，利用土壤中的某些低等动物蚯蚓、鼠类等吸收土壤中的重金属。细菌、放线菌对重金属更加敏感，格兰氏阳性菌可吸收Cd、Cu、Ni、Pb等重金属。[8] 植物方面的研究有印度芥菜（Brassica juncea）可对Cr、Cd、Ni、Zn、Cu富集分别能力分别为58，52，31，17，7倍。[9]高杆牧草（Agropyron elongatum）能吸收Cu等重金属。[10]化学与物理的方法多对环境有破坏，而生物的方法相比前者有成本低、无污染、无二次破坏、和更加自然化的优点。[11]植物修复技术的难题是如何对超积累植物或积累植物的筛选与保证植物的正常生长，其治理的效果取决于超积累植物或积累植物对重金属的吸收富集能力和其生物量[12]。
植物内生细菌(Entophyte)是指从表面消毒的植物组织中分离得到或从植物内部获得的能够定殖在健康植物各种组织和器官内，并未使植物的表型特征和功能发生改变的细菌。研究发现，分离自伯士隆庭荠的内生菌83%( 67株) 在镍胁迫下能分泌铁载体，并提高植物对镍、镉、钴、锌、铜等重金属毒性的抗性，从而促进植物在重金属胁迫土壤中生长。[13] 有些土壤细菌可以促进植物的健康生长，加强其根系的伸长和发展，或提高植物对逆境的耐受性这种细菌我们一般称之为植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)。[14]Zaidi et al认为植物根际促生菌所产的吲哚乙酸(Indole3acetic acid，IAA）能够促进植物的生长。[15] Hu和Boyer认为植物根际促生菌所产的铁载体能络合Fe3+，土壤中其他的重金属同时也能被溶出，植物能利用Fe3+和其他对生长有利的离子，使得植物更好生长。[16] 植物根际促生菌可以通过多种形式间接（通过促进植物生长发育）或直接（通过改变土壤中重金属的形态）影响植物对土壤中重金属的吸收。[14]本实验在分离纯化的众多微生物中，将其产生是否能产生IAA和其产量作为一个指标，将其产生的铁离子作为第二指标，经过一系列的测量和后期数据的处理，获得品质较好的细菌，然后再进过摇瓶吸附试验数据的筛选，获得能力最好的细菌对其进行保藏、鉴定后进行盆栽试验，以证明植物联合微生物修复土壤在实际变现中的可行性。
材料与方法
1.1细菌的初步筛选纯化
1.1.1采样
在汤山比较贫瘠（受重金属污染比较严重）的土地上寻找生长状态较好的植株，将小株的植株直接用铲子放进袋中，并在原本根的周围取一定量的土壤装入信封中，本实验取了两株植物和其周围的四份土样。
1.1.2 培养
准备6个洗干净的摇瓶，每个摇瓶中加入50mL的去离子水，放入玻璃珠子，其中四个称0.5g土样，尽量取小颗粒的，放入摇瓶中混匀。将两种植物的根、叶0.5g，用酒精洗净，在研钵中磨至匀浆，再放入摇瓶中摇匀。将每一个摇瓶中的菌悬液的浓度稀释至102、103、104。
富集培养：将培养基融化后把重金属浓度调至Cd2+各100mg/L，准备54块平板，每个浓度各涂三块。放入恒温箱中培养48h。
1.1.3 初步筛选
从培养基中选出一定菌落较大，长势较好的，用牙签环沾取少量，转移到新的已划好格子重金属平板上，培养48h，再在新的平板上去长势好，菌落丰满的菌移至新的重金属平板上富集培养，恒温箱培养48h，最后在挑出长势好菌落丰满的菌株，再另准备20个LB平板划线培养。一共取30个菌，编号L1L30。
1.2 IAA产量测定
配制有氮培养基，配制10mg/mL色氨酸溶液，准备试管，每根试管加3mL的有氮培养液150μL的配好的色氨酸溶液，灭菌，接入菌液200μL，培养72h。把培养好的菌液倒入5mL的离心管中8000rpm/min 5min，之后取上清1mL转入新的离心管中，再加50μL 10mmol/mL的正磷酸溶液，2mL 0.5mol/mL of reagen溶液，暗反应30min。530nm，测吸光度。
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/swgc/smkx/219.html
