水稻细胞凋亡相关抑制基因的耐镉性功能分析
：水稻是超过六成中国人的主食，但现在水稻的重金属污染问题日渐显现，尤其是水稻重金属中镉含量严重超标！在杂交水稻日益推广和普及的今天，镉污染产生的后果可能更加严重，因此对水稻进行耐镉性研究迫在眉睫。本实验是探究细胞凋亡相关抑制基因的耐镉性。以水稻cDNA为材料，采用RT-PCR技术克隆细胞凋亡抑制基因Bax inhibitor-1以及Subtilase family protein基因，先构建中间载体：T-载体，再构建目的载体：pYES2-目的基因载体。最后运用基因工程手段把目的基因转入对镉敏感酵母细胞，在含有一定浓度氯化镉的培养基上培养酵母细胞，观察酵母生长状况。从而验证基因的耐镉性。实验发现转入目的基因的酵母细胞的生长情况明显优于没有转入该基因的酵母细胞，从而说明基因Bax inhibitor-1使酵母获得一定的耐镉性。本研究不仅可以为提高植物耐镉性和镉污染治理做出贡献，也丰富了细胞凋亡抑制基因抑制细胞凋亡的机制。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract. 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 植物材料与处理 2
1.1.1 材料准备 2
1.1.2 浸种 2
1.1.3 催芽 2
1.1.4 点种 2
1.1.5 营养液 3
1.2 菌株与载体 3
1.3 酶与试剂 3
1.4 培养基配方及试剂配制 3
1.5 实验方法 3
1.5.1 水稻RNA的提取 3
1.5.2 水稻cDNA的合成 4
1.5.2 引物的设计与合成 4
1.5.3 引物退火温度的测定 4
1.5.4 在最适温度下进行PCR扩增并回收PCR产物 4
1.5.5 连接T载体并进行大肠杆菌转化 5
1.5.6 菌落PCR及接菌 5
1.5.7 小提质粒 5
1.5.8 酶切、回收并连接目的载体 5
1.5.9 重组质粒转化酵母细胞 6
1.5.10 酵母细胞耐镉性检测 6
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
/> 2 结果与分析 6
2.1 细胞凋亡抑制基因的引物序列 6
2.2 引物最适退火温度的测定 7
2.3 目的片段连T质粒测序结果 7
2.4 酵母细胞耐镉性检测 8
3 讨论 9
致谢 9
参考文献 10
水稻细胞凋亡相关抑制基因的耐镉性功能分析
引言
引言 重金属指密度高于5.0g/cm3的金属，在地表中存在的近90种元素中大约60%被称作重金属[1]。镉（cadmium，Cd）、汞(mercury，Hg)、铜(copper，Cu)、铁(iron，Fe)和铅(lead，Pb）等都是重金属。自然情况下，存在于矿石中的重金属由于矿石的风化和地壳运动把重金属暴露给植物[2]，但有研究表明频繁的人类活动如大范围的采矿、化肥的应用以及污泥的排放会加剧土壤中的重金属积累[3~5]。 过去两百年来，通过非自然的方式排放到环境中的有毒重金属已经超过自然途径[6]，成为全球性的环境与农产品安全生产问题[7]。镉是毒性最强的重金属之一，它是一种十分稀少且分布很分散的元素，主要用于电池、染料或塑胶的稳定剂，具有高移动性。镉在环境中不能降解，在土壤中具有较强的化学活性，与其他重金属相比更容易被植物吸收。由于其在植株体内具有隐蔽性，因而在不影响植物正常生长的情况下，植物往往可累积较高浓度的镉，并通过食物链在人和动物体内富集，导致人体肾脏对钙、磷的吸收效率下降，对维生素D的代谢产生异常，进而增加肾和骨病变的危险，引起“骨痛病”、“蛋白尿”“肺气肿”等病症。还有研究表明过量的Cd的摄入有致突变、致畸、致癌的“三致效应”[8]。
水稻是我国乃至世界上最重要的粮食作物之一，也是重要的战略性储备物资。由于水稻易从土壤中吸收重金属，尤其对镉胁迫较为敏感，所以稻田镉污染会导致水稻生长发育受阻，产量下降，更严重的是有毒金属镉在水稻体内大量累积，并通过食物链传递，对人和动物的生命和健康构成严重威胁，直接影响到我国的粮食安全[9]。因此，开展水稻对镉胁迫响应特性研究以及研究水稻中的抑制程序性细胞死亡的基因是否具有耐镉性对于农业生产，环境治理以及生态保护都具有重要意义。
研究发现水稻中的基因Bax inhibitor1是生物界普遍存在进化上比较保守的细胞凋亡抑制基因[10]。在脊椎动物中，BI 1特异性表达于胚胎发育中的肺组织、成年睾丸和大多数实体瘤，在正常成人的绝大多数组织中也有表达，可抑制依赖caspase(胱冬肽酶)和不依赖caspase的凋亡途径[11]。BI 1由于其特殊的作用机制及其在实体瘤中的特异性组织分布，将成为实体瘤诊断与治疗的重要新靶点。研究表明，基因BI1过表达可抑制真菌毒素及非生物胁迫诱导的细胞死亡，可以作为延缓或抑制生物或非生物胁迫引起衰老和死亡的重要调控因子，在植物的衰老与胁迫的相互作用中发挥着重要的作用[12]，但是它的作用机制目前尚未研究清楚。Subtilase famiy protein（枯草杆菌蛋白酶家族蛋白）是一类丝氨酸蛋白酶广泛存在于古细菌、细菌与真核生物中[13]。这类蛋白酶在结构上具有典型的 Asp/Ser/His 催化结构域，具有广泛的生理学功能，包括非特异性的降解蛋白功能，特异性参与多肽类激素的形成等。在植物中，植物枯草杆菌蛋白酶不仅参与叶片气孔形成、种子发育与细胞壁形成以及植物多肽类因子的合成，也参与植物生物与非生物胁迫反应。枯草杆菌蛋白酶基因家族也是一类很大的家族，例如在水稻中有63个成员，并且存在着明显的基因扩张进化。但是因为这类蛋白酶结构多样，且功能复杂，它的生物学功能及其基因家族的进化研究尚没有太多报道。
研究Bax inhibitor1，Subtilase family protein基因经镉处理后的功能，能丰富细胞凋亡抑制因子抑制细胞凋亡的作用机制[14]，还能起到缓解甚至解除镉污染对于作物的伤害的重要作用，为植物重金属污染研究做出贡献，从而提高植物耐镉性，进一步提高农作物产量和品质[15]。
1 材料与方法
1．1 植物材料与处理
本实验以水稻品种粳稻徐稻为试验材料。
1．1．1 材料准备
采用水培法种植水稻以确保水稻营养的一致性，且此方法简单、易操作。
1．1．2 浸种
将水稻用去离子水浸泡，去除上层的干瘪的种子；然后在水中加入适当的次氯酸钠消毒，浸泡5 min；换上新的去离子水，在温箱中浸泡一天。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract. 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 植物材料与处理 2
1.1.1 材料准备 2
1.1.2 浸种 2
1.1.3 催芽 2
1.1.4 点种 2
1.1.5 营养液 3
1.2 菌株与载体 3
1.3 酶与试剂 3
1.4 培养基配方及试剂配制 3
1.5 实验方法 3
1.5.1 水稻RNA的提取 3
1.5.2 水稻cDNA的合成 4
1.5.2 引物的设计与合成 4
1.5.3 引物退火温度的测定 4
1.5.4 在最适温度下进行PCR扩增并回收PCR产物 4
1.5.5 连接T载体并进行大肠杆菌转化 5
1.5.6 菌落PCR及接菌 5
1.5.7 小提质粒 5
1.5.8 酶切、回收并连接目的载体 5
1.5.9 重组质粒转化酵母细胞 6
1.5.10 酵母细胞耐镉性检测 6
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
/> 2 结果与分析 6
2.1 细胞凋亡抑制基因的引物序列 6
2.2 引物最适退火温度的测定 7
2.3 目的片段连T质粒测序结果 7
2.4 酵母细胞耐镉性检测 8
3 讨论 9
致谢 9
参考文献 10
水稻细胞凋亡相关抑制基因的耐镉性功能分析
引言
引言 重金属指密度高于5.0g/cm3的金属，在地表中存在的近90种元素中大约60%被称作重金属[1]。镉（cadmium，Cd）、汞(mercury，Hg)、铜(copper，Cu)、铁(iron，Fe)和铅(lead，Pb）等都是重金属。自然情况下，存在于矿石中的重金属由于矿石的风化和地壳运动把重金属暴露给植物[2]，但有研究表明频繁的人类活动如大范围的采矿、化肥的应用以及污泥的排放会加剧土壤中的重金属积累[3~5]。 过去两百年来，通过非自然的方式排放到环境中的有毒重金属已经超过自然途径[6]，成为全球性的环境与农产品安全生产问题[7]。镉是毒性最强的重金属之一，它是一种十分稀少且分布很分散的元素，主要用于电池、染料或塑胶的稳定剂，具有高移动性。镉在环境中不能降解，在土壤中具有较强的化学活性，与其他重金属相比更容易被植物吸收。由于其在植株体内具有隐蔽性，因而在不影响植物正常生长的情况下，植物往往可累积较高浓度的镉，并通过食物链在人和动物体内富集，导致人体肾脏对钙、磷的吸收效率下降，对维生素D的代谢产生异常，进而增加肾和骨病变的危险，引起“骨痛病”、“蛋白尿”“肺气肿”等病症。还有研究表明过量的Cd的摄入有致突变、致畸、致癌的“三致效应”[8]。
水稻是我国乃至世界上最重要的粮食作物之一，也是重要的战略性储备物资。由于水稻易从土壤中吸收重金属，尤其对镉胁迫较为敏感，所以稻田镉污染会导致水稻生长发育受阻，产量下降，更严重的是有毒金属镉在水稻体内大量累积，并通过食物链传递，对人和动物的生命和健康构成严重威胁，直接影响到我国的粮食安全[9]。因此，开展水稻对镉胁迫响应特性研究以及研究水稻中的抑制程序性细胞死亡的基因是否具有耐镉性对于农业生产，环境治理以及生态保护都具有重要意义。
研究发现水稻中的基因Bax inhibitor1是生物界普遍存在进化上比较保守的细胞凋亡抑制基因[10]。在脊椎动物中，BI 1特异性表达于胚胎发育中的肺组织、成年睾丸和大多数实体瘤，在正常成人的绝大多数组织中也有表达，可抑制依赖caspase(胱冬肽酶)和不依赖caspase的凋亡途径[11]。BI 1由于其特殊的作用机制及其在实体瘤中的特异性组织分布，将成为实体瘤诊断与治疗的重要新靶点。研究表明，基因BI1过表达可抑制真菌毒素及非生物胁迫诱导的细胞死亡，可以作为延缓或抑制生物或非生物胁迫引起衰老和死亡的重要调控因子，在植物的衰老与胁迫的相互作用中发挥着重要的作用[12]，但是它的作用机制目前尚未研究清楚。Subtilase famiy protein（枯草杆菌蛋白酶家族蛋白）是一类丝氨酸蛋白酶广泛存在于古细菌、细菌与真核生物中[13]。这类蛋白酶在结构上具有典型的 Asp/Ser/His 催化结构域，具有广泛的生理学功能，包括非特异性的降解蛋白功能，特异性参与多肽类激素的形成等。在植物中，植物枯草杆菌蛋白酶不仅参与叶片气孔形成、种子发育与细胞壁形成以及植物多肽类因子的合成，也参与植物生物与非生物胁迫反应。枯草杆菌蛋白酶基因家族也是一类很大的家族，例如在水稻中有63个成员，并且存在着明显的基因扩张进化。但是因为这类蛋白酶结构多样，且功能复杂，它的生物学功能及其基因家族的进化研究尚没有太多报道。
研究Bax inhibitor1，Subtilase family protein基因经镉处理后的功能，能丰富细胞凋亡抑制因子抑制细胞凋亡的作用机制[14]，还能起到缓解甚至解除镉污染对于作物的伤害的重要作用，为植物重金属污染研究做出贡献，从而提高植物耐镉性，进一步提高农作物产量和品质[15]。
1 材料与方法
1．1 植物材料与处理
本实验以水稻品种粳稻徐稻为试验材料。
1．1．1 材料准备
采用水培法种植水稻以确保水稻营养的一致性，且此方法简单、易操作。
1．1．2 浸种
将水稻用去离子水浸泡，去除上层的干瘪的种子；然后在水中加入适当的次氯酸钠消毒，浸泡5 min；换上新的去离子水，在温箱中浸泡一天。
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