plya基因参与粘细菌发育机制的研究
：粘细菌是具有社会性行为的一类原核生物，与其他种类细菌相比，具有独特的运动方式以及类似于真核的多细胞生活阶段。粘细菌被认为在原核生物向真核生物进化过程中具有重要地位，成为了研究多细胞结构形成机制的一种良好模型。在营养缺乏的应激条件下，粘细菌启动复杂的生活周期，大量细胞有序聚集，形成子实体结构，在子实体内部分细胞程序性死亡，其他细胞逐渐分化为对环境具有抗逆性的粘孢子。目前关于子实体的研究主要集中在子实体的形成机制以及子实体的外部结构组成等方面，近年来的研究表明，胞外多糖与粘细菌发育进程有着密切的联系，在群体运动以及子实体形成过程中发挥重要作用。本研究以模式菌株Myxococcus xanthus DK1622为材料，结合相关的基因敲除的方法，对一个与多糖合成相关的基因plyA在粘细菌的发育过程具体的机制进行研究。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1 菌株及质粒2
1.1.2 培养基3
1.1.3 实验试剂及仪器耗材3
1.2实验方法 3
1.2.1同源重组基因片段的克隆3
1.2.2 plyAPBJ113载体的构建 5
1.2.3 黄色粘球菌DK1622的电转化5
1.2.4基因插入失活菌株营养阶段的表型变化6
1.2.5基因插入失活菌株在营养缺陷型平板上的表型变化6
2 结果与分析6
2.1 同源重组基因片段的克隆6
2.1.1 PCR扩增同源片段7
2.1.2 plyAT载体的构建及扩增7
2.2 plyAPBJ113载体的构建7
2.2.1 质粒载体PBJll3的提取和目的片段回收7
2.2.2 plyAPBJ113载体的构建8
2.3 同源重组基因片段的克隆黄色粘球菌DK1622的电转化9
2.3.1 黄色粘球菌DK1622的电转化及筛选纯化9
2.3.2 重组菌的验证9
2.4基因
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
插入失活菌株营养阶段的表型变化9
2.5基因插入失活菌株在营养缺陷型平板上的表型变化10
3 讨论 10
致谢11
参考文献11
PlyA基因参与粘细菌Myxococcus xanthus发育机制的研究
引言
引言 粘细菌（Myxobacteria）是一类呈杆状的革兰氏阴性菌，大小为3~12*0.7~1.2 μm，在分类上属于变形细菌门(Preteobacteria)的δ分支[1]，分为3 个亚目17个属50 多个种[2]。目前为止，粘细菌的基因组在已测定的的原核生物中是最大的，黄色粘球菌的基因组大小为9.45 Mb[3]，如此庞大的基因组在其复杂的多细胞发育过程中起到了基础作用。
粘细菌的多细胞行为主要包括:具有双运动系统的滑动运动,子实体和粘孢子的分化发育过程和社会性细胞行为[4]。粘细菌的滑动运动包含两种不同的模式，单独性运动（A）和社会型运动（S），这两种运动模式都可以帮助粘细菌在固体表面运动，不同的是，A运动负责单个细胞在相对坚硬、干燥的表面上的移动，而在S运动负责细胞群在相对柔软和潮湿的表面上的运动[5]，有实验表明：A运动在含1.5%琼脂的硬琼脂表面上占优势,而S运动则在含0.3%琼脂的软琼脂表面上展现明显的优势[6]。这种双运动系统在粘细菌适应不同生存环境中起到了重要作用。
粘细菌中的S运动是一种非鞭毛依赖的滑动运动系统，负责细菌在柔软固体表面上的群体运动。S运动系统需要IV型菌毛、胞外多糖（EPS）和脂多糖（LPS）。TFP介导的S运动依靠菌毛的伸缩性与其他细胞的胞外基质相连，在菌毛收缩的同时提供细胞前进的动力[7]。纤丝中的胞外多糖构成了为TPF提供锚定位点的基底[8]。该EPS由单糖甘露糖，半乳糖，半乳糖，葡萄糖胺，N乙酰胺糖，葡萄糖，鼠李糖和木糖组成，但其大分子结构未知。研究表明，EPS中聚合的氨基糖（例如，几丁质），最有可能在TFP结合和收缩时发挥锚定基底的作用。
在粘细菌中，EPS已经被证实与S运动、相邻细胞间粘附和子实体形成密切相关。目前确定了两个基因的区域为胞外多糖生物合成必不可少的：EPS合成（EPS）区域和EPS相关（EAS）的区域。在EPS和EAS区域发生插入突变的菌株S运动和子实体的形成都有缺陷。根据以往的研究，EPS缺失突变体不能结合白色荧光（CFW）染料[9]，表明其不能形成胞外多糖。进一步的遗传突变分析表明，整个区域EPS涉及原纤维和原纤维的EPS的生物合成[10]。这些突变体使细菌自产生EPS或表达与EPS相关的功能时显示出不同程度的缺陷，证实这些基因在粘细菌的EPS的生物合成中发挥了作用。
子实体作为一种保护机制，在粘细菌应对不同生存环境方面起到了重要作用。在营养相对丰富的环境中，粘细菌可以同时利用其双运动系统在不同环境下进行正常的发育扩展和捕食行为。一旦外界环境恶化，营养物质减少，粘细菌便会开始进行子实体的发育形成子实体和抗逆性的粘孢子[11]。在细胞饥饿发生46 h后，细胞不断向中心移动积累到一定数量后形成细胞堆，24 h左右可以形成透明子实体，当子实体形成约72 h后，仅有少数子实体周边的细菌仍然保持杆状形态[12]，保留分化和运动的能力，内部大多数细菌都发育成为了粘孢子。而多数研究表明胞外多糖在子实体形成的过程起着非常重要的作用，在子实体形成前期细胞开始聚集的时候可能参与细胞间的信号传导，在子实体成熟期，子实体结构外部被多糖包围，对于子实体抵抗不良的环境具有很好的保护作用。
本实验室早期通过实验发现一系列与EPS的合成运输相关的基因，以模式菌株Myxococcus Xanthus DK1622为研究对象发现，一旦这些基因功能受到影响，EPS的合成以及子实体的形成都将表现出缺陷。本实验结合生物信息学分析方法、基因敲除以及基因的表观发育分析方法对一个多糖合成相关的基因plyA的调控功能进行了综合分析，通过对该菌株多糖合成、多细胞运动以及子实体形成缺陷进行研究，阐述了其参与Myxococcus xanthus的发育分子机制。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 菌株及质粒
本部分实验所使用的粘球菌菌株、大肠杆菌菌株和质粒载体如表11所示：
表11本章节实验所使用菌株和质粒
菌株和质粒
Strain or plasmid
Genotype or description
Source
菌株
Strain
M. xanthus DK1622
野生菌株，用于粘细菌发育分析菌株
本实验室保存，毛晓华教授赠送
E.coil DH5α
用于载体构建
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1 菌株及质粒2
1.1.2 培养基3
1.1.3 实验试剂及仪器耗材3
1.2实验方法 3
1.2.1同源重组基因片段的克隆3
1.2.2 plyAPBJ113载体的构建 5
1.2.3 黄色粘球菌DK1622的电转化5
1.2.4基因插入失活菌株营养阶段的表型变化6
1.2.5基因插入失活菌株在营养缺陷型平板上的表型变化6
2 结果与分析6
2.1 同源重组基因片段的克隆6
2.1.1 PCR扩增同源片段7
2.1.2 plyAT载体的构建及扩增7
2.2 plyAPBJ113载体的构建7
2.2.1 质粒载体PBJll3的提取和目的片段回收7
2.2.2 plyAPBJ113载体的构建8
2.3 同源重组基因片段的克隆黄色粘球菌DK1622的电转化9
2.3.1 黄色粘球菌DK1622的电转化及筛选纯化9
2.3.2 重组菌的验证9
2.4基因
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
插入失活菌株营养阶段的表型变化9
2.5基因插入失活菌株在营养缺陷型平板上的表型变化10
3 讨论 10
致谢11
参考文献11
PlyA基因参与粘细菌Myxococcus xanthus发育机制的研究
引言
引言 粘细菌（Myxobacteria）是一类呈杆状的革兰氏阴性菌，大小为3~12*0.7~1.2 μm，在分类上属于变形细菌门(Preteobacteria)的δ分支[1]，分为3 个亚目17个属50 多个种[2]。目前为止，粘细菌的基因组在已测定的的原核生物中是最大的，黄色粘球菌的基因组大小为9.45 Mb[3]，如此庞大的基因组在其复杂的多细胞发育过程中起到了基础作用。
粘细菌的多细胞行为主要包括:具有双运动系统的滑动运动,子实体和粘孢子的分化发育过程和社会性细胞行为[4]。粘细菌的滑动运动包含两种不同的模式，单独性运动（A）和社会型运动（S），这两种运动模式都可以帮助粘细菌在固体表面运动，不同的是，A运动负责单个细胞在相对坚硬、干燥的表面上的移动，而在S运动负责细胞群在相对柔软和潮湿的表面上的运动[5]，有实验表明：A运动在含1.5%琼脂的硬琼脂表面上占优势,而S运动则在含0.3%琼脂的软琼脂表面上展现明显的优势[6]。这种双运动系统在粘细菌适应不同生存环境中起到了重要作用。
粘细菌中的S运动是一种非鞭毛依赖的滑动运动系统，负责细菌在柔软固体表面上的群体运动。S运动系统需要IV型菌毛、胞外多糖（EPS）和脂多糖（LPS）。TFP介导的S运动依靠菌毛的伸缩性与其他细胞的胞外基质相连，在菌毛收缩的同时提供细胞前进的动力[7]。纤丝中的胞外多糖构成了为TPF提供锚定位点的基底[8]。该EPS由单糖甘露糖，半乳糖，半乳糖，葡萄糖胺，N乙酰胺糖，葡萄糖，鼠李糖和木糖组成，但其大分子结构未知。研究表明，EPS中聚合的氨基糖（例如，几丁质），最有可能在TFP结合和收缩时发挥锚定基底的作用。
在粘细菌中，EPS已经被证实与S运动、相邻细胞间粘附和子实体形成密切相关。目前确定了两个基因的区域为胞外多糖生物合成必不可少的：EPS合成（EPS）区域和EPS相关（EAS）的区域。在EPS和EAS区域发生插入突变的菌株S运动和子实体的形成都有缺陷。根据以往的研究，EPS缺失突变体不能结合白色荧光（CFW）染料[9]，表明其不能形成胞外多糖。进一步的遗传突变分析表明，整个区域EPS涉及原纤维和原纤维的EPS的生物合成[10]。这些突变体使细菌自产生EPS或表达与EPS相关的功能时显示出不同程度的缺陷，证实这些基因在粘细菌的EPS的生物合成中发挥了作用。
子实体作为一种保护机制，在粘细菌应对不同生存环境方面起到了重要作用。在营养相对丰富的环境中，粘细菌可以同时利用其双运动系统在不同环境下进行正常的发育扩展和捕食行为。一旦外界环境恶化，营养物质减少，粘细菌便会开始进行子实体的发育形成子实体和抗逆性的粘孢子[11]。在细胞饥饿发生46 h后，细胞不断向中心移动积累到一定数量后形成细胞堆，24 h左右可以形成透明子实体，当子实体形成约72 h后，仅有少数子实体周边的细菌仍然保持杆状形态[12]，保留分化和运动的能力，内部大多数细菌都发育成为了粘孢子。而多数研究表明胞外多糖在子实体形成的过程起着非常重要的作用，在子实体形成前期细胞开始聚集的时候可能参与细胞间的信号传导，在子实体成熟期，子实体结构外部被多糖包围，对于子实体抵抗不良的环境具有很好的保护作用。
本实验室早期通过实验发现一系列与EPS的合成运输相关的基因，以模式菌株Myxococcus Xanthus DK1622为研究对象发现，一旦这些基因功能受到影响，EPS的合成以及子实体的形成都将表现出缺陷。本实验结合生物信息学分析方法、基因敲除以及基因的表观发育分析方法对一个多糖合成相关的基因plyA的调控功能进行了综合分析，通过对该菌株多糖合成、多细胞运动以及子实体形成缺陷进行研究，阐述了其参与Myxococcus xanthus的发育分子机制。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 菌株及质粒
本部分实验所使用的粘球菌菌株、大肠杆菌菌株和质粒载体如表11所示：
表11本章节实验所使用菌株和质粒
菌株和质粒
Strain or plasmid
Genotype or description
Source
菌株
Strain
M. xanthus DK1622
野生菌株，用于粘细菌发育分析菌株
本实验室保存，毛晓华教授赠送
E.coil DH5α
用于载体构建
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