水稻甲硫氨酸亚砜还原酶OsMSRB3基因的克隆和表达分析
水稻甲硫氨酸亚砜还原酶OsMSRB3基因的克隆和表达分析[20200614171615]
摘要：铜（Cu）是具有氧化还原特性的重金属，过量Cu容易引起植物的氧化胁迫。本实验室利用2D-PAGE技术，发现Cu胁迫引起了水稻甲硫氨酸亚砜还原酶（OsMsr）的表达显著增加，这说明OsMSR也许参与了水稻对铜胁迫的响应。本实验在此基础上，利用RT-PCR技术克隆OsMSRB3基因，该基因ORF为690bp，编码229氨基酸。进化树分析表明OsMSRB3与小麦进化关系最近，分成明显的2簇。OsMSRB3基因表达分析发现，OsMSRB3基因主要在叶片中表达，在根系及茎中也有表达，但均低于在叶片中的表达。OsMSRB3基因也受铜的强烈诱导，5 μM铜处理使OsMSRB3的表达比对照高4.0倍。上述结果表明，OsMSRB3具有组织表达和铜诱导表达的特性。另外，我们还对缺乏水稻OsMSRB3基因的水稻突变体进行了筛选、鉴定；获得了5株杂合体株系，为鉴定到纯合株系。
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关键字:甲硫氨酸亚砜还原酶；基因克隆；组织表达；诱导表达；突变体
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）3
1材料与方法4
1.1材料 4
1.2方法 4
1.2.1 OsMSRB3基因克隆4
1.2.2 OsMSRB3基因表达5
1.2.3 OsMSRB3基因突变体筛选5
2 结果与分析7
2.1 OsMSRB3基因克隆分析7
2.2 OsMSRB3基因表达分析9
2.3 OsMSRB3基因突变体筛选11
3讨论13
4 结论14
致谢15
参考文献15
附录A 溶液配方 16
附录B T-pMD19载体（Simple）结构图17
附录C测序结果与目的基因序列在NCBI上比对结果18
水稻甲硫氨酸亚砜还原酶OsMSRB3基因的克隆和表达分析
生物技术 朱鑫
引言
引言
铜（Cu）是植物在生长和发育过程中必须的微量营养元素，在植物体内的代谢过程里铜有着很重要的作用，比如在光合作用，呼吸作用，激素信号感受[1]等中。然而Cu也是一种重金属，具有氧化还原特性，Cu+氧化会产生H2O2和OH[2]，过量的Cu会氧化胁迫对植物造成伤害。从文献中了解到，过量的Cu能引起H2O2在植物质外体的积累[3]。植物对这些胁迫也有自己的方法来减轻对其的伤害，如植物能调节某些功能基因的表达量，进而调节对应功能蛋白的量，来抵抗重金属的胁迫。
水稻是一种非常重要的粮食作物，在世界各地广泛种植。并且由于水稻有一个很完善的数据库， *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
常常将其作为模式植物研究。在我们最近的研究结果也表明，Cu胁迫可以诱导水稻甲硫氨酸亚砜还原酶（MSR）的表达量显著增加[4]。甲硫氨酸亚砜还原酶（MSR）可以将生物体内的甲硫氨酸–R,S–亚砜还原为甲硫氨酸。而甲硫氨酸（Met）是多肽和蛋白质的重要组成部分，但Met易被H2O2、羟自由基等活性氧氧化成甲硫氨酸–R,S–亚砜，使Met所在的多肽和蛋白质活性降低甚至失去活性。
目前已知的甲硫氨酸亚砜还原酶有MsrA（methionine-S-sulfoxide reductase），MsrB（methionine-R-sulfoxide reductase）和fRMsr（free methionine-R-sulfoxide reductase）三类。MsrA，于1978年在大肠杆菌中发现；MsrB，于2001年在大肠杆菌中发现；fRMsr，于2007年在大肠杆菌中发现。随着研究的不断进行，有在拟南芥[5]、棉花[6]、粳稻[7]、番茄[8]中发现硫氨酸亚砜还原酶基因。其中水稻中含有4个OsMSRA和3个OsMSRB[9]，其表达受ABA、甘露醇、低温胁迫、盐胁迫的诱导，OsMSRA4.1基因的过量表达还可提高水稻盐胁迫下的存活力。但目前，对Cu胁迫下甲硫氨酸亚砜还原酶在水稻中的作用还研究甚少。
从目前的研究成果，可推断在铜胁迫下水稻对OsMSR基因的表达量上升，将被氧化的甲硫氨酸–R,S–亚砜还原为甲硫氨酸，使相关蛋白保持活性，抵抗铜胁迫。本实验研究水稻中OsMSRB3基因，对其进行克隆并进行生物信息学分析。OsMSRB3基因组织表达和铜诱导表达进行分析，明确其组织表达和铜诱导表达的特性。旨在阐明OsMSRB3在植物耐铜性中的生理功能及作用机理。还对缺乏水稻OsMSRB3基因的水稻突变体进行了筛选，为之后的相关研究作铺垫。
1 材料与方法
1.1材料
水稻粳稻品种日本晴（Oryza sativa L.cv.Nipponbare）；两种DongJing品种 OsMSRB3基因突变体，购自RiceGE (http://signal.salk.edu/cgi-bin/RiceGE)，编号分别为：PFG_1B-04235.L、PFG_1A-21853.L
1.2方法
1.2.1 OsMSRB3基因克隆
1.2.1.1 实验材料的准备
水稻用木村B营养液培养后，用TaKara公司的RNA提取试剂盒提取水稻总RNA，并用TaKara公司的反转录试剂盒反转成cDNA。
1.2.1.2 OsMSRB3引物的设计
在Rice Genome Annotation Project网站上输入OsMSRB3基因的loc号 LOC_Os05
g33510，得到OsMSRB3基因的cDNA序列，用Primer Premier 5引物设计软件设计一对合适引物，基因总长为690，引物序列为ACACGCCAAGGAAGAAAA和CTGTTCTATTGCGGGCTTA，并检测。
1.2.1.3 OsMSRB3基因目的片段的回收
用TaKaRa公司的La Taq酶（with GC buffer），按照PCR体系：94℃，1min；94℃,30s；
60℃,30s；72℃ *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
,2min；72℃,5min做PCR，然后用1%的琼脂糖凝胶电泳，再用TaKaRa公司的切胶回收试剂盒进行胶回收。
1.2.1.4 连接，转化，培养
用TaKaRa公司的pMD?18-T Vector试剂盒将OsMSRB3基因片段与载体连接，将其放置在16℃3h.将2μl的连接产物加入50μl Escherichia coli DH5α的感受态细胞中，轻轻搅拌后在冰上放置29min。42℃热激90秒，置于冰上2min。加入500μl无抗生素的LB液体培养基。37℃，150rpm震荡培养1小时。取200μl涂布于含AMP和IPTG、X-Gal的LB平板。37℃过夜培养。
1.2.1.5菌落PCR检测
挑选LB平板上的白色单菌落，加入1mL含AMP的液体LB培养基中37℃震荡培养3-4小时，取1μl菌液为模板，进行菌液PCR。
1.2.1.6 质粒的提取，酶切验证
挑选LB平板上的白色单菌落，放于4mL含AMP的液体LB培养基中，37℃摇床震荡过夜培养，用于提取质粒。用TaKaRa公司的质粒提取试剂盒提取转化后的质粒，用HindШ单酶切37℃3小时，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.1.7 测序，菌种保存，比对
将菌液PCR检测合格的菌液送到金唯智公司测序，其余菌液用甘油混合后放置于-80℃保存。测序后，将测序结果在NCBI上与OsMSRB3基因的cDNA序列比对
1.2.2 OsMSRB3基因表达
组织表达，水稻（日本晴）用木村B营养液培养后，用TaKaRa公司的RNA提取试剂盒分别提取提取水稻根、茎、叶总RNA，并用TaKaRa公司的反转录试剂盒反转成cDNA。诱导表达，水稻（日本晴）用木村B营养液培养2周后，分别用1μM,2μM,5μM,10μM的Cu2+处理两天，同样提取RNA，反转成cDNA。
（1） 半定量的分析 在Rice Genome Annotation Project网站上输入OsMSRB3基因的loc号 LOC_Os05g33510，得到OsMSRB3基因的cDNA序列，用Primer Premier 5引物设计软件设计一对合适引物，基因长400，引物序列为CTCTTCGCTGAGGGTGTTTATG和GACTGTTCTATTGCGGGCTTA。以GAPDH为内参引物，引物序列为ACCACAAACTGCCTTGCTCC和ATGCTCGACCTGCTGTCACC进行标定。组织表达中，用叶、根、茎的cDNA为模板PCR，1.5%的琼脂糖凝胶电泳，比较电泳条带的亮暗。诱导表达中，用不同浓度铜处理的叶、根、茎的cDNA为模板PCR，1.5%的琼脂糖凝胶电泳，比较电泳条带的亮暗。
摘要：铜（Cu）是具有氧化还原特性的重金属，过量Cu容易引起植物的氧化胁迫。本实验室利用2D-PAGE技术，发现Cu胁迫引起了水稻甲硫氨酸亚砜还原酶（OsMsr）的表达显著增加，这说明OsMSR也许参与了水稻对铜胁迫的响应。本实验在此基础上，利用RT-PCR技术克隆OsMSRB3基因，该基因ORF为690bp，编码229氨基酸。进化树分析表明OsMSRB3与小麦进化关系最近，分成明显的2簇。OsMSRB3基因表达分析发现，OsMSRB3基因主要在叶片中表达，在根系及茎中也有表达，但均低于在叶片中的表达。OsMSRB3基因也受铜的强烈诱导，5 μM铜处理使OsMSRB3的表达比对照高4.0倍。上述结果表明，OsMSRB3具有组织表达和铜诱导表达的特性。另外，我们还对缺乏水稻OsMSRB3基因的水稻突变体进行了筛选、鉴定；获得了5株杂合体株系，为鉴定到纯合株系。
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关键字:甲硫氨酸亚砜还原酶；基因克隆；组织表达；诱导表达；突变体
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）3
1材料与方法4
1.1材料 4
1.2方法 4
1.2.1 OsMSRB3基因克隆4
1.2.2 OsMSRB3基因表达5
1.2.3 OsMSRB3基因突变体筛选5
2 结果与分析7
2.1 OsMSRB3基因克隆分析7
2.2 OsMSRB3基因表达分析9
2.3 OsMSRB3基因突变体筛选11
3讨论13
4 结论14
致谢15
参考文献15
附录A 溶液配方 16
附录B T-pMD19载体（Simple）结构图17
附录C测序结果与目的基因序列在NCBI上比对结果18
水稻甲硫氨酸亚砜还原酶OsMSRB3基因的克隆和表达分析
生物技术 朱鑫
引言
引言
铜（Cu）是植物在生长和发育过程中必须的微量营养元素，在植物体内的代谢过程里铜有着很重要的作用，比如在光合作用，呼吸作用，激素信号感受[1]等中。然而Cu也是一种重金属，具有氧化还原特性，Cu+氧化会产生H2O2和OH[2]，过量的Cu会氧化胁迫对植物造成伤害。从文献中了解到，过量的Cu能引起H2O2在植物质外体的积累[3]。植物对这些胁迫也有自己的方法来减轻对其的伤害，如植物能调节某些功能基因的表达量，进而调节对应功能蛋白的量，来抵抗重金属的胁迫。
水稻是一种非常重要的粮食作物，在世界各地广泛种植。并且由于水稻有一个很完善的数据库， *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
常常将其作为模式植物研究。在我们最近的研究结果也表明，Cu胁迫可以诱导水稻甲硫氨酸亚砜还原酶（MSR）的表达量显著增加[4]。甲硫氨酸亚砜还原酶（MSR）可以将生物体内的甲硫氨酸–R,S–亚砜还原为甲硫氨酸。而甲硫氨酸（Met）是多肽和蛋白质的重要组成部分，但Met易被H2O2、羟自由基等活性氧氧化成甲硫氨酸–R,S–亚砜，使Met所在的多肽和蛋白质活性降低甚至失去活性。
目前已知的甲硫氨酸亚砜还原酶有MsrA（methionine-S-sulfoxide reductase），MsrB（methionine-R-sulfoxide reductase）和fRMsr（free methionine-R-sulfoxide reductase）三类。MsrA，于1978年在大肠杆菌中发现；MsrB，于2001年在大肠杆菌中发现；fRMsr，于2007年在大肠杆菌中发现。随着研究的不断进行，有在拟南芥[5]、棉花[6]、粳稻[7]、番茄[8]中发现硫氨酸亚砜还原酶基因。其中水稻中含有4个OsMSRA和3个OsMSRB[9]，其表达受ABA、甘露醇、低温胁迫、盐胁迫的诱导，OsMSRA4.1基因的过量表达还可提高水稻盐胁迫下的存活力。但目前，对Cu胁迫下甲硫氨酸亚砜还原酶在水稻中的作用还研究甚少。
从目前的研究成果，可推断在铜胁迫下水稻对OsMSR基因的表达量上升，将被氧化的甲硫氨酸–R,S–亚砜还原为甲硫氨酸，使相关蛋白保持活性，抵抗铜胁迫。本实验研究水稻中OsMSRB3基因，对其进行克隆并进行生物信息学分析。OsMSRB3基因组织表达和铜诱导表达进行分析，明确其组织表达和铜诱导表达的特性。旨在阐明OsMSRB3在植物耐铜性中的生理功能及作用机理。还对缺乏水稻OsMSRB3基因的水稻突变体进行了筛选，为之后的相关研究作铺垫。
1 材料与方法
1.1材料
水稻粳稻品种日本晴（Oryza sativa L.cv.Nipponbare）；两种DongJing品种 OsMSRB3基因突变体，购自RiceGE (http://signal.salk.edu/cgi-bin/RiceGE)，编号分别为：PFG_1B-04235.L、PFG_1A-21853.L
1.2方法
1.2.1 OsMSRB3基因克隆
1.2.1.1 实验材料的准备
水稻用木村B营养液培养后，用TaKara公司的RNA提取试剂盒提取水稻总RNA，并用TaKara公司的反转录试剂盒反转成cDNA。
1.2.1.2 OsMSRB3引物的设计
在Rice Genome Annotation Project网站上输入OsMSRB3基因的loc号 LOC_Os05
g33510，得到OsMSRB3基因的cDNA序列，用Primer Premier 5引物设计软件设计一对合适引物，基因总长为690，引物序列为ACACGCCAAGGAAGAAAA和CTGTTCTATTGCGGGCTTA，并检测。
1.2.1.3 OsMSRB3基因目的片段的回收
用TaKaRa公司的La Taq酶（with GC buffer），按照PCR体系：94℃，1min；94℃,30s；
60℃,30s；72℃ *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
,2min；72℃,5min做PCR，然后用1%的琼脂糖凝胶电泳，再用TaKaRa公司的切胶回收试剂盒进行胶回收。
1.2.1.4 连接，转化，培养
用TaKaRa公司的pMD?18-T Vector试剂盒将OsMSRB3基因片段与载体连接，将其放置在16℃3h.将2μl的连接产物加入50μl Escherichia coli DH5α的感受态细胞中，轻轻搅拌后在冰上放置29min。42℃热激90秒，置于冰上2min。加入500μl无抗生素的LB液体培养基。37℃，150rpm震荡培养1小时。取200μl涂布于含AMP和IPTG、X-Gal的LB平板。37℃过夜培养。
1.2.1.5菌落PCR检测
挑选LB平板上的白色单菌落，加入1mL含AMP的液体LB培养基中37℃震荡培养3-4小时，取1μl菌液为模板，进行菌液PCR。
1.2.1.6 质粒的提取，酶切验证
挑选LB平板上的白色单菌落，放于4mL含AMP的液体LB培养基中，37℃摇床震荡过夜培养，用于提取质粒。用TaKaRa公司的质粒提取试剂盒提取转化后的质粒，用HindШ单酶切37℃3小时，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.1.7 测序，菌种保存，比对
将菌液PCR检测合格的菌液送到金唯智公司测序，其余菌液用甘油混合后放置于-80℃保存。测序后，将测序结果在NCBI上与OsMSRB3基因的cDNA序列比对
1.2.2 OsMSRB3基因表达
组织表达，水稻（日本晴）用木村B营养液培养后，用TaKaRa公司的RNA提取试剂盒分别提取提取水稻根、茎、叶总RNA，并用TaKaRa公司的反转录试剂盒反转成cDNA。诱导表达，水稻（日本晴）用木村B营养液培养2周后，分别用1μM,2μM,5μM,10μM的Cu2+处理两天，同样提取RNA，反转成cDNA。
（1） 半定量的分析 在Rice Genome Annotation Project网站上输入OsMSRB3基因的loc号 LOC_Os05g33510，得到OsMSRB3基因的cDNA序列，用Primer Premier 5引物设计软件设计一对合适引物，基因长400，引物序列为CTCTTCGCTGAGGGTGTTTATG和GACTGTTCTATTGCGGGCTTA。以GAPDH为内参引物，引物序列为ACCACAAACTGCCTTGCTCC和ATGCTCGACCTGCTGTCACC进行标定。组织表达中，用叶、根、茎的cDNA为模板PCR，1.5%的琼脂糖凝胶电泳，比较电泳条带的亮暗。诱导表达中，用不同浓度铜处理的叶、根、茎的cDNA为模板PCR，1.5%的琼脂糖凝胶电泳，比较电泳条带的亮暗。
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