菌株pigmentiphagasp.？h8中orf3311介导3溴4羟基苯甲酸的降解
3,5-二溴-4-羟基苯甲酸（3,5-dibromo-4-hydroxybenzoate, DBHB）和3-溴-4-羟基苯甲酸（3-bromo-4-hydroxybenzoate, BHB）是除草剂溴苯腈在环境中代谢的主要中间产物，由于溴原子的存在，导致其对环境安全和人类健康具有潜在的威胁。本实验室前期从菌株Pigmentiphaga sp. H8中发现了DBHB和BHB的氧化脱羧途径即氧化脱羧酶OdcA首先将DBHB和BHB分别转化为2,6-二溴对苯二酚和2-溴对苯二酚。然而，进一步研究发现odcA的突变株H8ΔodcA仍然可以降解BHB，说明菌株H8中还存在第二条BHB的代谢途径。因此，本研究以菌株H8为研究对象，揭示BHB降解的新途径。BHB诱导降解实验表明菌株H8降解BHB的酶受BHB的诱导，因此通过比较转录组学和比较蛋白质组学技术，成功预测了orf3309-3311基因簇参与BHB降解。通过异源表达、体外酶学等实验，证实了orf3311（命名为brhA）编码的单加氧酶BrhA参与BHB的起始降解，将其转化为3-溴-4,5-二羟基苯甲酸。本研究为今后深入解析BrhA的催化机制提供了工作基础，同时也丰富了卤代芳烃微生物降解的理论基础。
目录
摘要 3
关键词 3
Key words 3
引言 4
1 材料与方法 4
1. 1 材料与试剂 4
1.1.1 试剂与培养基 4
1.1.2 菌株、质粒与引物 4
1.2 菌株H8对BHB的诱导降解实验 5
1.3 BHB降解关键基因的克隆 5
1.3.1 细菌总RNA的提取与转录组测序 5
1.3.2 细菌总蛋白的提取与蛋白质组测序 5
1.4 预测基因的功能验证 6
1.5 BHB降解关键酶BrhA的表达和纯化 6
1.5.1 重组高效表达载体的构建 6
1.5.2 重组蛋白BrhAHis6的表达和纯化 6
1.5.3 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE） 6
1.6 BrhA的酶学特性 6
1.7 BHB及其 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
代谢产物的检测 7
2 结果与分析 7
2.1 菌株H8对BHB的诱导降解实验 7
2.2 菌株H8的比较转录组学与比较蛋白质组学分析 7
2.3 orf407和orf3311的功能验证 8
2.4 BHB降解关键酶BrhA的表达和纯化 9
2.5 BrhA的酶学特性 10
2.5.1 温度对BrhA酶活的影响 10
2.5.2 pH值对BrhA酶活的影响 10
3 讨论 11
菌株Pigmentiphaga sp. H8中orf3311介导
3溴4羟基苯甲酸的降解
引言
卤代芳烃化合物由于具有耐疲劳、阻燃、稳定、高毒等特性，因此被广泛应用于工农业生产活动中，如除草剂、杀菌剂、杀虫剂、阻燃剂、医药和助溶剂等[1]。由于卤代芳烃的广泛应用，导致大量的卤代芳烃释放到环境中。由于卤素原子的强电子吸附效应，使得卤代芳烃稳定性和极性增强，并易与生命细胞内的酶系统结合进而对生命细胞产生毒性和致畸性，对生态环境和人类健康造成严重的威胁[2,3]。微生物是环境中卤代芳烃降解的主力军，研究卤代芳烃的微生物降解与污染修复具有十分重要的意义。
3,5二溴4羟基苯甲酸（3,5dibromo4hydroxybenzoate, DBHB）和3溴4羟基苯甲酸（3bromo4hydroxybenzoate, BHB）是除草剂溴苯腈在环境中代谢的主要中间产物 [4,5]。由于溴原子的存在，导致其对环境安全和人类健康具有潜在的威胁[6,7]。本实验室前期从长期受卤代芳烃污染的土壤中分离筛选到一株DBHB和BHB的高效降解菌株Pigmentiphaga sp. H8，该菌株能在24 h内完全降解0.2 mM的DBHB和BHB，并能以其为唯一碳源和能源生长。前期从菌株H8中发现了DBHB和BHB的氧化脱羧途径：即氧化脱羧酶OdcA首先将DBHB和BHB分别转化为2,6二溴对苯二酚和2溴对苯二酚[8]。然而，odcA的突变株H8ΔodcA仍然可以降解BHB，说明菌株H8中还存在第二条BHB的代谢途径。因此，本研究继续以菌株H8为研究对象，揭示其降解BHB的新途径，克隆该途径的关键降解酶基因，通过异源表达和纯化研究关键降解酶的酶学特性。本研究预期成果不仅丰富了卤代芳烃的微生物降解机制，也为今后揭示BHB关键降解酶的催化机制提供基础，为卤代芳烃污染的生物修复提供新的基因和酶资源。
1 材料与方法
1. 1 材料与试剂
1.1.1 试剂与培养基
基础盐培养基（MSM）：NH4NO3 1.0 g，K2HPO4 1.6 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO4 0.2 g，NaCl 1.0 g，去离子水1000 ml，pH 7.2±0.2；Lysogeny broth (LB) 培养基：蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g，NaCl 5.0 g，去离子水1000 ml，pH 7.2±0.2[9]。液体培养基中添加2%的琼脂即可制成固体培养基。
凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自AXYGEN公司。PrimeSTAR DNA聚合酶、dNTP、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、IPTG等分子试剂购自大连宝生物公司（TaKaRa Biotechnology Co. Ltd）。DBHB和BHB等化学标准品购自上海百灵威化学试剂公司（J&K Scientific，Ltd），用甲醇配置成浓度为20 mM的母液备用。液相色谱和质谱检测过程中所用的甲醇和乙酸乙酯等有机试剂均为色谱纯，其他化学试剂均为分析纯，购自江苏汉邦科技有限公司和北京鼎国生物技术有限公司。引物合成与DNA测序委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
1.1.2 菌株、质粒与引物
本实验中所使用的菌株和质粒如表1所示，所使用的引物及其序列如表2所示。
表1 本研究所用的菌株和质粒
Table 1 Strains and plasmids used in this study
菌株和质粒
目录
摘要 3
关键词 3
Key words 3
引言 4
1 材料与方法 4
1. 1 材料与试剂 4
1.1.1 试剂与培养基 4
1.1.2 菌株、质粒与引物 4
1.2 菌株H8对BHB的诱导降解实验 5
1.3 BHB降解关键基因的克隆 5
1.3.1 细菌总RNA的提取与转录组测序 5
1.3.2 细菌总蛋白的提取与蛋白质组测序 5
1.4 预测基因的功能验证 6
1.5 BHB降解关键酶BrhA的表达和纯化 6
1.5.1 重组高效表达载体的构建 6
1.5.2 重组蛋白BrhAHis6的表达和纯化 6
1.5.3 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE） 6
1.6 BrhA的酶学特性 6
1.7 BHB及其 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
代谢产物的检测 7
2 结果与分析 7
2.1 菌株H8对BHB的诱导降解实验 7
2.2 菌株H8的比较转录组学与比较蛋白质组学分析 7
2.3 orf407和orf3311的功能验证 8
2.4 BHB降解关键酶BrhA的表达和纯化 9
2.5 BrhA的酶学特性 10
2.5.1 温度对BrhA酶活的影响 10
2.5.2 pH值对BrhA酶活的影响 10
3 讨论 11
菌株Pigmentiphaga sp. H8中orf3311介导
3溴4羟基苯甲酸的降解
引言
卤代芳烃化合物由于具有耐疲劳、阻燃、稳定、高毒等特性，因此被广泛应用于工农业生产活动中，如除草剂、杀菌剂、杀虫剂、阻燃剂、医药和助溶剂等[1]。由于卤代芳烃的广泛应用，导致大量的卤代芳烃释放到环境中。由于卤素原子的强电子吸附效应，使得卤代芳烃稳定性和极性增强，并易与生命细胞内的酶系统结合进而对生命细胞产生毒性和致畸性，对生态环境和人类健康造成严重的威胁[2,3]。微生物是环境中卤代芳烃降解的主力军，研究卤代芳烃的微生物降解与污染修复具有十分重要的意义。
3,5二溴4羟基苯甲酸（3,5dibromo4hydroxybenzoate, DBHB）和3溴4羟基苯甲酸（3bromo4hydroxybenzoate, BHB）是除草剂溴苯腈在环境中代谢的主要中间产物 [4,5]。由于溴原子的存在，导致其对环境安全和人类健康具有潜在的威胁[6,7]。本实验室前期从长期受卤代芳烃污染的土壤中分离筛选到一株DBHB和BHB的高效降解菌株Pigmentiphaga sp. H8，该菌株能在24 h内完全降解0.2 mM的DBHB和BHB，并能以其为唯一碳源和能源生长。前期从菌株H8中发现了DBHB和BHB的氧化脱羧途径：即氧化脱羧酶OdcA首先将DBHB和BHB分别转化为2,6二溴对苯二酚和2溴对苯二酚[8]。然而，odcA的突变株H8ΔodcA仍然可以降解BHB，说明菌株H8中还存在第二条BHB的代谢途径。因此，本研究继续以菌株H8为研究对象，揭示其降解BHB的新途径，克隆该途径的关键降解酶基因，通过异源表达和纯化研究关键降解酶的酶学特性。本研究预期成果不仅丰富了卤代芳烃的微生物降解机制，也为今后揭示BHB关键降解酶的催化机制提供基础，为卤代芳烃污染的生物修复提供新的基因和酶资源。
1 材料与方法
1. 1 材料与试剂
1.1.1 试剂与培养基
基础盐培养基（MSM）：NH4NO3 1.0 g，K2HPO4 1.6 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO4 0.2 g，NaCl 1.0 g，去离子水1000 ml，pH 7.2±0.2；Lysogeny broth (LB) 培养基：蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g，NaCl 5.0 g，去离子水1000 ml，pH 7.2±0.2[9]。液体培养基中添加2%的琼脂即可制成固体培养基。
凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自AXYGEN公司。PrimeSTAR DNA聚合酶、dNTP、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、IPTG等分子试剂购自大连宝生物公司（TaKaRa Biotechnology Co. Ltd）。DBHB和BHB等化学标准品购自上海百灵威化学试剂公司（J&K Scientific，Ltd），用甲醇配置成浓度为20 mM的母液备用。液相色谱和质谱检测过程中所用的甲醇和乙酸乙酯等有机试剂均为色谱纯，其他化学试剂均为分析纯，购自江苏汉邦科技有限公司和北京鼎国生物技术有限公司。引物合成与DNA测序委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
1.1.2 菌株、质粒与引物
本实验中所使用的菌株和质粒如表1所示，所使用的引物及其序列如表2所示。
表1 本研究所用的菌株和质粒
Table 1 Strains and plasmids used in this study
菌株和质粒
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