马铃薯hsfs响应油菜素甾醇调控耐热的初步研究
马铃薯是一种重要的粮蔬作物，受全球气候变暖影响，产量大减，如何提高其耐热性已成为迫在眉睫的问题。油菜素甾醇(brassinosteroids，BRs）是一种植物激素，研究发现它能够提高许多植物的耐热性，但是否能提高马铃薯的耐热性尚不清楚。另外，热激转录因子（Heat Shock Transcription Factors，HSFs）能够激活热胁迫的响应基因，从而抵抗热胁迫，这与油菜素甾醇提高耐热性是否有关系也是不清楚的。为了解析这些问题，本课题通过外源油菜素甾醇的施加，观察马铃薯在热胁迫下的叶片萎焉情况和存活率，发现油菜素甾醇确实能够提高马铃薯的耐热性。并且通过定量PCR揭示热胁迫下油菜素甾醇合成和转导信号都放大。接着，通过定量PCR检测热胁迫与油菜素甾醇处理后的Hsfs的表达变化，挑选出StHsf018，StHsf024，StHsf026这三个同时受热和激素诱导的基因作为响应BRs调控马铃薯耐热性的候选Hsfs，为进一步探索其中复杂的分子机制打下基础。
目录
摘要.3
关键词.3
Abstract..........3
Key words3
引言.3
1 材料与方法.................6
1.1 材料 ................6
1.1.1 植物材料...................6
1.1.2 MS培养基.................6
1.1.3 酶与化学试剂.......7
1.2 方法 ................7
1.2.1 样品处理...................7
1.2.2 Trizol法提取RNA.....7
1.2.3 反转录合成cDNA第一链.......8
1.2.4 PCR调平内参基因亮度........................8
1.2.5 Realtime Quantification PCR.......8
1.2.6 数据处理...................9
2 结果与分析.9
2.1 油菜素甾醇促进 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
马铃薯耐热性的表型分析..9
2.2 定量PCR揭示热胁迫下油菜素甾醇信号变化...11
2.3定量PCR检测油菜素甾醇与热胁迫处理后的Hsfs的表达变化........12
2.3.1 定量PCR检测0.3 μM eBL处理对Hsfs的表达变化........12
2.3.2定量PCR检测热处理不同时长对Hsfs的表达变化.....13
3 讨论................14
3.1 外源施加eBL缓解马铃薯热胁迫损伤的表型特征........................................................14
3.2 热胁迫下油菜素甾醇合成途径和信号通路关键酶的响应机制....................................14
3.3 响应油菜素甾醇调控马铃薯耐热性的候选Hsfs............................................................14
致谢.......14
参考文献...14
附录A BRs合成途径与信号通路关键酶引物序列15
附录B Hsfs引物序列................................................................15
马铃薯HSFs响应油菜素甾醇调控耐热的初步研究
引言
马铃薯（Solanum tuberosum L.）是继小麦，玉米和水稻之后的世界第四大重要粮食作物[1]，其块茎是主要食用部分，富含大量的淀粉、胡萝卜素和蛋白质等营养元素，是非常重要的食物来源。目前，我国农业部提出要推动马铃薯的主粮化，这意味着随着马铃薯在农业与食品领域的地位日益上升，马铃薯作物的相关研究也将越发重要。
随着温室效应的加剧，全球气候变暖已经成为现代农业生产所面临的严峻挑战。高温使得马铃薯块茎内外层细胞分裂速度产生不平衡，造成开裂现象，严重影响马铃薯产量。因此，如何提高马铃薯耐热性，防止块茎减产的同时，亦可扩大马铃薯的种植范围和种植周期，已成为一大热点研究问题。
1. 油菜素甾醇合成和信号转导途径
油菜素甾醇 (Brassinosteroids, BRs) 是一类多羟基的类固醇植物激素[2]，在调控植物的生长发育过程中发挥了重要作用，其中包括细胞伸长、细胞分裂及分化、叶脉形成、茎干延长、光形态建成和繁殖发育、衰老和逆境胁迫响应等[3]。
油菜素甾醇的合成和信号转导途径，在模式植物拟南芥和水稻中都已经研究的比较透彻。
在拟南芥中，BR的生物合成由CR (campesterol) 起始，受多种油菜素内酯合成酶（Brassinolide synthetase）的催化，经由多条途径最终形成生物活性最高的油菜素内酯（epibrassinolide，BL）[2]（图1）。
图1 油菜素甾醇的生物合成途径示意图[2]
不依赖于CN (campestanol)的合成途径是拟南芥BL生物合成的主要途径，主要包括DWF4，CPD，DET2，BR6ox1 (CYP85A1)和BR6ox2 (CYP85A2)等关键酶。其中DWF4是C22位羟化酶，它所催化的步骤是整个合成途径的限速步骤，过表达DWF4可明显促进植物生长[4]。CPD是C3位氧化酶，它与DWF4都受到BL的负反馈抑制性调节，BZR1可识别并结合它们的启动子区并下调其表达[5]。DET2编码5α还原酶，催化油菜甾醇转变为油菜甾烷醇，且不受BL负调控机制的调节[6] 。在拟南芥中，BR6ox1 (CYP85A1)和BR6ox2 (CYP85A2) 是C6氧化酶，而在水稻和番茄中与之同源的蛋白是DWARF。 BR6ox1和BR6ox2均受到BL的负反馈抑制性调节, 且有证据表明BR6ox1是BZR1的靶基因 [2]。
在拟南芥中，BR信号转导途径起始于细胞膜上。在没有BR的情况下，受体BRI1的C末端进行自我抑制的同时，BRI1和它的抑制因子BKI1结合，完全抑制BRI1的活性，磷酸化的激酶BIN2具有活性，将下游转录因子BES1/BZR1磷酸化，磷酸化后的BES1/BZR1或被26S蛋白酶体所降解，或被1433蛋白滞留在细胞质中，无法激活下游的BR响应基因；当BR出现时， BRI1和BAK1的胞外结构域共同感知BR，进而引起BKI1从BRI1上解离，并使BRI1和BAK1的激酶结构域相互作用并相互磷酸化激活，激活的BRI1可磷酸化激活BSKs和CDGs，BSKs和CDGs再激活下游磷酸酶BSU1，BSU1可去磷酸化失活负调控元件BIN2，从而解除BIN2对下游转录因子BZR1和BES1的磷酸化抑制，非磷酸化的BZR1和BES1进入细胞核，结合到BR响应基因的启动子区域，与转录因子MYB30和BIM1一起激活下游BR响应基因的表达，进而调节多项植物生长发育过程[2,7]（图2）。
目录
摘要.3
关键词.3
Abstract..........3
Key words3
引言.3
1 材料与方法.................6
1.1 材料 ................6
1.1.1 植物材料...................6
1.1.2 MS培养基.................6
1.1.3 酶与化学试剂.......7
1.2 方法 ................7
1.2.1 样品处理...................7
1.2.2 Trizol法提取RNA.....7
1.2.3 反转录合成cDNA第一链.......8
1.2.4 PCR调平内参基因亮度........................8
1.2.5 Realtime Quantification PCR.......8
1.2.6 数据处理...................9
2 结果与分析.9
2.1 油菜素甾醇促进 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
马铃薯耐热性的表型分析..9
2.2 定量PCR揭示热胁迫下油菜素甾醇信号变化...11
2.3定量PCR检测油菜素甾醇与热胁迫处理后的Hsfs的表达变化........12
2.3.1 定量PCR检测0.3 μM eBL处理对Hsfs的表达变化........12
2.3.2定量PCR检测热处理不同时长对Hsfs的表达变化.....13
3 讨论................14
3.1 外源施加eBL缓解马铃薯热胁迫损伤的表型特征........................................................14
3.2 热胁迫下油菜素甾醇合成途径和信号通路关键酶的响应机制....................................14
3.3 响应油菜素甾醇调控马铃薯耐热性的候选Hsfs............................................................14
致谢.......14
参考文献...14
附录A BRs合成途径与信号通路关键酶引物序列15
附录B Hsfs引物序列................................................................15
马铃薯HSFs响应油菜素甾醇调控耐热的初步研究
引言
马铃薯（Solanum tuberosum L.）是继小麦，玉米和水稻之后的世界第四大重要粮食作物[1]，其块茎是主要食用部分，富含大量的淀粉、胡萝卜素和蛋白质等营养元素，是非常重要的食物来源。目前，我国农业部提出要推动马铃薯的主粮化，这意味着随着马铃薯在农业与食品领域的地位日益上升，马铃薯作物的相关研究也将越发重要。
随着温室效应的加剧，全球气候变暖已经成为现代农业生产所面临的严峻挑战。高温使得马铃薯块茎内外层细胞分裂速度产生不平衡，造成开裂现象，严重影响马铃薯产量。因此，如何提高马铃薯耐热性，防止块茎减产的同时，亦可扩大马铃薯的种植范围和种植周期，已成为一大热点研究问题。
1. 油菜素甾醇合成和信号转导途径
油菜素甾醇 (Brassinosteroids, BRs) 是一类多羟基的类固醇植物激素[2]，在调控植物的生长发育过程中发挥了重要作用，其中包括细胞伸长、细胞分裂及分化、叶脉形成、茎干延长、光形态建成和繁殖发育、衰老和逆境胁迫响应等[3]。
油菜素甾醇的合成和信号转导途径，在模式植物拟南芥和水稻中都已经研究的比较透彻。
在拟南芥中，BR的生物合成由CR (campesterol) 起始，受多种油菜素内酯合成酶（Brassinolide synthetase）的催化，经由多条途径最终形成生物活性最高的油菜素内酯（epibrassinolide，BL）[2]（图1）。
图1 油菜素甾醇的生物合成途径示意图[2]
不依赖于CN (campestanol)的合成途径是拟南芥BL生物合成的主要途径，主要包括DWF4，CPD，DET2，BR6ox1 (CYP85A1)和BR6ox2 (CYP85A2)等关键酶。其中DWF4是C22位羟化酶，它所催化的步骤是整个合成途径的限速步骤，过表达DWF4可明显促进植物生长[4]。CPD是C3位氧化酶，它与DWF4都受到BL的负反馈抑制性调节，BZR1可识别并结合它们的启动子区并下调其表达[5]。DET2编码5α还原酶，催化油菜甾醇转变为油菜甾烷醇，且不受BL负调控机制的调节[6] 。在拟南芥中，BR6ox1 (CYP85A1)和BR6ox2 (CYP85A2) 是C6氧化酶，而在水稻和番茄中与之同源的蛋白是DWARF。 BR6ox1和BR6ox2均受到BL的负反馈抑制性调节, 且有证据表明BR6ox1是BZR1的靶基因 [2]。
在拟南芥中，BR信号转导途径起始于细胞膜上。在没有BR的情况下，受体BRI1的C末端进行自我抑制的同时，BRI1和它的抑制因子BKI1结合，完全抑制BRI1的活性，磷酸化的激酶BIN2具有活性，将下游转录因子BES1/BZR1磷酸化，磷酸化后的BES1/BZR1或被26S蛋白酶体所降解，或被1433蛋白滞留在细胞质中，无法激活下游的BR响应基因；当BR出现时， BRI1和BAK1的胞外结构域共同感知BR，进而引起BKI1从BRI1上解离，并使BRI1和BAK1的激酶结构域相互作用并相互磷酸化激活，激活的BRI1可磷酸化激活BSKs和CDGs，BSKs和CDGs再激活下游磷酸酶BSU1，BSU1可去磷酸化失活负调控元件BIN2，从而解除BIN2对下游转录因子BZR1和BES1的磷酸化抑制，非磷酸化的BZR1和BES1进入细胞核，结合到BR响应基因的启动子区域，与转录因子MYB30和BIM1一起激活下游BR响应基因的表达，进而调节多项植物生长发育过程[2,7]（图2）。
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