一种放线菌复壮、诱变以及生物学特性的分析与比较
一种放线菌复壮、诱变以及生物学特性的分析与比较[20200614170320]
摘要：多抗霉素是一种安全低毒的杀菌剂，在生态农业和食品安全生产上应用前景广阔。本次毕业实习以一种放线菌为研究材料，探索研究通过诱变从菌株中获得较高产量的技术方法。通过复壮为诱变提供强壮的基础菌株，在这过程中通过斜面培养基营养调控来解决传代不稳定的情况，使用液相色谱仪测量多抗霉素含量，经过正交实验设计来简便操作过程，从中挑选出优势菌种。对菌株进行紫外诱变，在众多的诱变因素中，改变菌株紫外诱变时间来分析其对菌株的影响。比较复壮和诱变过程中菌株生理状态和形态特征上的改变，通过多个方面来分析比较这些条件对菌株高产的影响。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
关键字:多抗霉素；复壮；诱变；放线菌
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1 菌株来源2
1.1.2 培养基2
1.2复壮 2
1.2.1检测菌种活性2
1.2.2初筛3
1.2.3 复筛3
1.2.4 发酵以及液相分析3
1.3 诱变3
1.3.1单孢子悬浮液制备4
1.3.2平板培养4
1.3.3发酵及液相分析4
1.3.4传代培养4
2 结果与分析4
2.1复壮4
2.1.1平板计数结果分析4
2.1.2 液相分析5
2.2 诱变8
2.1.1平板计数结果分析8
2.1.2 液相分析9
3 讨论10
3.1 形态特征10
3.2 生理特性10
3.3 最优平面培养基配比10
3.4 最优液体培养基11
致谢11
参考文献11
一种放线菌复壮、诱变以及生物学特性的分析和比较
引言
引言
多抗霉素是一种高效、低毒、无环境污染的抗生素类杀菌剂， 被广泛运用在作物、瓜果的种植当中，研究表明多抗霉素对苹果斑点落叶病[1]、小麦赤霉病[2]、水稻稻瘟病[3]的防治有很好的效果。在食品安全问题日益严峻的今天，化学农药、抗生素的滥用导致了土地、水体、作物的污染，严重影响了生态系统。多抗霉素这种易分解、无毒性的生物农药的使用对促进我国的无 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
公害食品、有机食品、绿色食品的发展有着至关重要的作用。
工业生产上为了获得高产菌株，采用了诱变的方法，而诱变需要复壮获得稳定的菌种。本次毕业设计使用的正是一种多抗霉素工业生产菌种，在实验室培育中，先通过复壮来使保藏的菌株恢复活性，在这一过程中，主要研究了不同营养物浓度的平面培养基对菌种生长的影响，希望通过平面培养基的改良，能够使菌种保持较高的活性生长，对多抗霉素的产量的提高产生影响。将获得的优良菌株进行紫外诱变，研究了不同照射时间对菌种诱变的影响。在以上过程中，通过液相分析多抗霉素含量来比较获得能够产高量多抗霉素菌株的条件，最终得到稳定产生优良菌株的系统的方法。
中国在1971年的时候就从金色产色链霉菌中发酵获得了多抗霉素，但无论是产品质量还是产能， 都无法国外的产品抗衡， 出口量很少， 基本上是限于国内市场经济作物上应用[4]。而在国内市场中，由于多抗霉素产量并不是很高，所以价格较贵，多用于高档农产品的使用，而在这过程中造成主要的影响因素是菌株产量的不稳定。在之前的实验中常出现高产菌株不稳定的情况，之前已经有人做过种子培养基和发酵培养基的改良，为了解决这种情况，在复壮过程中我对平面培养基做出改良。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1 菌株来源
冰箱中保藏的产多抗霉素工业菌株。
1.1.2 培养基
（1）种子培养基（豆粉1%，玉米粉2%，葡萄糖1%，磷酸二氢钾0.1%，氯化钠0.1%，甘露醇0.5%，调节ph至6.5，然后加入碳酸钙0.3%）用于孢子快速的生长成熟。
（2）发酵培养基（豆粉2%，玉米粉1.5%，麦芽糖2%，磷酸二氢钾0.1%，氯化钠0.1%，硫酸镁0.1%，调节ph至6.5，加入碳酸钙0.3%）用于促进放线菌发酵生产多抗霉素。
（3）斜面培养基或平板培养基（麦芽糖，玉米粉，酵母膏，琼脂2%，调节ph至6.3）用于菌种保藏活化以及诱变处理。通过调节培养基配方，来研究传代的稳定性与培养基的关系。
1.2复壮
菌种经过长期保藏后往往会被杂菌污染或者出现退化的现象，这会导致菌种活力的下降，因此对菌种检测活性并且从已退化的菌种中找出优势菌种是必须的。菌种退化主要是三种情况：活性下降导致所需性状的较少；繁殖能力下降导致产孢子减少；代谢能力下降。通过初筛，先将冰箱中取出的菌株扩大培养，在用不同的培养基进行复筛，从中找出最适合的培养基。使菌种能保持较高能力的传代。
复壮：初始菌种——》种子培养基、发酵培养基培养——》发酵液预处理——》液相检测——》斜面扩大培养——》改变营养元素同步培养——》平板稀释涂布——》菌落数目计数——》斜面培养初筛——》斜面培养复筛——》斜面培养自然分离和再复筛——》保藏及扩大实验
1.2.1 检测菌种活性
首先要活化菌种，配制100ml种子培养基2个；灭菌后，待培养基降至室温，即可在超净工作台进行挑菌接种，然后将培养基放入恒温摇床（28℃，180r/min，2d）； 配制10个50ml发酵培养基；灭菌后进行百分之十接种，即从种子培养基中吸取5ml培养基接入发酵培养基，然后放入恒温摇床（28℃，180r/min，4d）；后来液相检测结果，菌种有活性，可以用于复壮诱变；制备斜面培养基，并接种，用于平板分离单菌落和试 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
管较长时间保藏。
1.2.2 初筛
配置斜面培养基（琼脂2%，ph=6.3，麦芽糖1%，玉米粉0.5%，酵母膏0.4%）按10-4、10-5、10-6稀释涂布于平板培养基，置于28 ℃培养箱恒温培养10d。平板菌落计数并进行液相分析。配制100ml种子培养基3个；灭菌后，待培养基降至室温，即可在超净工作台进行挑菌接种，然后将培养基放入恒温摇床（28℃，180r/min，2d）； 配制9个50ml发酵培养基；灭菌后进行百分之十接种，即从种子培养基中吸取5ml培养基接入发酵培养基，然后放入恒温摇床（28℃，180r/min，4d）进行液相分析。
1.2.3 复筛
总共27种培养基，每种3个重复见表1。挑选初筛中长势较好的菌株，按10-4、10-5、10-6稀释涂布于平板培养基，置于28 ℃培养箱恒温培养10d。平板菌落计数。（第一个数字表示麦芽糖的浓度，第二个数字表示玉米粉的浓度，第三个数字表示酵母膏的浓度，数字的大小即该物质由小到大的3个梯度。比如培养基233指的是麦芽糖1%、玉米粉1%、酵母膏1.2%；培养基312指的是麦芽糖1.5%、玉米粉0%、0.8%），平板菌落计数。
表1培养基浓度配比
琼脂2%，ph=6.3 1 2 3
1 麦芽糖 0.5% 1% 1.5%
2 玉米粉 0% 0.5% 1%
3 酵母膏 0.4% 0.8% 1.2%
1.2.4 发酵以及液相分析
配制100ml种子培养基6个；灭菌后，待培养基降至室温，即可在超净工作台进行挑菌接种，然后将培养基放入恒温摇床（28℃，180r/min，2d）； 配制18个50ml发酵培养基；灭菌后进行百分之十接种，即从种子培养基中吸取5ml培养基接入发酵培养基，然后放入恒温摇床（28℃，180r/min，4d）进行液相分析。
液相色谱操作条件：甲醇-0.2mol/L醋酸铵（醋酸调ph=4.0）(体积比1:99)；流速0.6ml/min；进样量0.2ml；所测峰在5.7min左右[5]。
摘要：多抗霉素是一种安全低毒的杀菌剂，在生态农业和食品安全生产上应用前景广阔。本次毕业实习以一种放线菌为研究材料，探索研究通过诱变从菌株中获得较高产量的技术方法。通过复壮为诱变提供强壮的基础菌株，在这过程中通过斜面培养基营养调控来解决传代不稳定的情况，使用液相色谱仪测量多抗霉素含量，经过正交实验设计来简便操作过程，从中挑选出优势菌种。对菌株进行紫外诱变，在众多的诱变因素中，改变菌株紫外诱变时间来分析其对菌株的影响。比较复壮和诱变过程中菌株生理状态和形态特征上的改变，通过多个方面来分析比较这些条件对菌株高产的影响。
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关键字:多抗霉素；复壮；诱变；放线菌
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摘要1
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引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1 菌株来源2
1.1.2 培养基2
1.2复壮 2
1.2.1检测菌种活性2
1.2.2初筛3
1.2.3 复筛3
1.2.4 发酵以及液相分析3
1.3 诱变3
1.3.1单孢子悬浮液制备4
1.3.2平板培养4
1.3.3发酵及液相分析4
1.3.4传代培养4
2 结果与分析4
2.1复壮4
2.1.1平板计数结果分析4
2.1.2 液相分析5
2.2 诱变8
2.1.1平板计数结果分析8
2.1.2 液相分析9
3 讨论10
3.1 形态特征10
3.2 生理特性10
3.3 最优平面培养基配比10
3.4 最优液体培养基11
致谢11
参考文献11
一种放线菌复壮、诱变以及生物学特性的分析和比较
引言
引言
多抗霉素是一种高效、低毒、无环境污染的抗生素类杀菌剂， 被广泛运用在作物、瓜果的种植当中，研究表明多抗霉素对苹果斑点落叶病[1]、小麦赤霉病[2]、水稻稻瘟病[3]的防治有很好的效果。在食品安全问题日益严峻的今天，化学农药、抗生素的滥用导致了土地、水体、作物的污染，严重影响了生态系统。多抗霉素这种易分解、无毒性的生物农药的使用对促进我国的无 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
公害食品、有机食品、绿色食品的发展有着至关重要的作用。
工业生产上为了获得高产菌株，采用了诱变的方法，而诱变需要复壮获得稳定的菌种。本次毕业设计使用的正是一种多抗霉素工业生产菌种，在实验室培育中，先通过复壮来使保藏的菌株恢复活性，在这一过程中，主要研究了不同营养物浓度的平面培养基对菌种生长的影响，希望通过平面培养基的改良，能够使菌种保持较高的活性生长，对多抗霉素的产量的提高产生影响。将获得的优良菌株进行紫外诱变，研究了不同照射时间对菌种诱变的影响。在以上过程中，通过液相分析多抗霉素含量来比较获得能够产高量多抗霉素菌株的条件，最终得到稳定产生优良菌株的系统的方法。
中国在1971年的时候就从金色产色链霉菌中发酵获得了多抗霉素，但无论是产品质量还是产能， 都无法国外的产品抗衡， 出口量很少， 基本上是限于国内市场经济作物上应用[4]。而在国内市场中，由于多抗霉素产量并不是很高，所以价格较贵，多用于高档农产品的使用，而在这过程中造成主要的影响因素是菌株产量的不稳定。在之前的实验中常出现高产菌株不稳定的情况，之前已经有人做过种子培养基和发酵培养基的改良，为了解决这种情况，在复壮过程中我对平面培养基做出改良。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1 菌株来源
冰箱中保藏的产多抗霉素工业菌株。
1.1.2 培养基
（1）种子培养基（豆粉1%，玉米粉2%，葡萄糖1%，磷酸二氢钾0.1%，氯化钠0.1%，甘露醇0.5%，调节ph至6.5，然后加入碳酸钙0.3%）用于孢子快速的生长成熟。
（2）发酵培养基（豆粉2%，玉米粉1.5%，麦芽糖2%，磷酸二氢钾0.1%，氯化钠0.1%，硫酸镁0.1%，调节ph至6.5，加入碳酸钙0.3%）用于促进放线菌发酵生产多抗霉素。
（3）斜面培养基或平板培养基（麦芽糖，玉米粉，酵母膏，琼脂2%，调节ph至6.3）用于菌种保藏活化以及诱变处理。通过调节培养基配方，来研究传代的稳定性与培养基的关系。
1.2复壮
菌种经过长期保藏后往往会被杂菌污染或者出现退化的现象，这会导致菌种活力的下降，因此对菌种检测活性并且从已退化的菌种中找出优势菌种是必须的。菌种退化主要是三种情况：活性下降导致所需性状的较少；繁殖能力下降导致产孢子减少；代谢能力下降。通过初筛，先将冰箱中取出的菌株扩大培养，在用不同的培养基进行复筛，从中找出最适合的培养基。使菌种能保持较高能力的传代。
复壮：初始菌种——》种子培养基、发酵培养基培养——》发酵液预处理——》液相检测——》斜面扩大培养——》改变营养元素同步培养——》平板稀释涂布——》菌落数目计数——》斜面培养初筛——》斜面培养复筛——》斜面培养自然分离和再复筛——》保藏及扩大实验
1.2.1 检测菌种活性
首先要活化菌种，配制100ml种子培养基2个；灭菌后，待培养基降至室温，即可在超净工作台进行挑菌接种，然后将培养基放入恒温摇床（28℃，180r/min，2d）； 配制10个50ml发酵培养基；灭菌后进行百分之十接种，即从种子培养基中吸取5ml培养基接入发酵培养基，然后放入恒温摇床（28℃，180r/min，4d）；后来液相检测结果，菌种有活性，可以用于复壮诱变；制备斜面培养基，并接种，用于平板分离单菌落和试 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
管较长时间保藏。
1.2.2 初筛
配置斜面培养基（琼脂2%，ph=6.3，麦芽糖1%，玉米粉0.5%，酵母膏0.4%）按10-4、10-5、10-6稀释涂布于平板培养基，置于28 ℃培养箱恒温培养10d。平板菌落计数并进行液相分析。配制100ml种子培养基3个；灭菌后，待培养基降至室温，即可在超净工作台进行挑菌接种，然后将培养基放入恒温摇床（28℃，180r/min，2d）； 配制9个50ml发酵培养基；灭菌后进行百分之十接种，即从种子培养基中吸取5ml培养基接入发酵培养基，然后放入恒温摇床（28℃，180r/min，4d）进行液相分析。
1.2.3 复筛
总共27种培养基，每种3个重复见表1。挑选初筛中长势较好的菌株，按10-4、10-5、10-6稀释涂布于平板培养基，置于28 ℃培养箱恒温培养10d。平板菌落计数。（第一个数字表示麦芽糖的浓度，第二个数字表示玉米粉的浓度，第三个数字表示酵母膏的浓度，数字的大小即该物质由小到大的3个梯度。比如培养基233指的是麦芽糖1%、玉米粉1%、酵母膏1.2%；培养基312指的是麦芽糖1.5%、玉米粉0%、0.8%），平板菌落计数。
表1培养基浓度配比
琼脂2%，ph=6.3 1 2 3
1 麦芽糖 0.5% 1% 1.5%
2 玉米粉 0% 0.5% 1%
3 酵母膏 0.4% 0.8% 1.2%
1.2.4 发酵以及液相分析
配制100ml种子培养基6个；灭菌后，待培养基降至室温，即可在超净工作台进行挑菌接种，然后将培养基放入恒温摇床（28℃，180r/min，2d）； 配制18个50ml发酵培养基；灭菌后进行百分之十接种，即从种子培养基中吸取5ml培养基接入发酵培养基，然后放入恒温摇床（28℃，180r/min，4d）进行液相分析。
液相色谱操作条件：甲醇-0.2mol/L醋酸铵（醋酸调ph=4.0）(体积比1:99)；流速0.6ml/min；进样量0.2ml；所测峰在5.7min左右[5]。
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