灵芝hog1MAPK基因的沉默和表型分析
灵芝hog1MAPK基因的沉默和表型分析[20200614171723]
摘要：灵芝是一种重要的药用真菌，其次级代谢产物灵芝三萜是其主要药用成分之一。前人研究表明，灵芝Hog1 MAPK可能在灵芝的次级代谢和细胞凋亡过程中起重要调控作用，但目前相关作用机制还不清楚，本文旨在探究hog1 MAPK在灵芝生长和三萜合成中的作用。首先根据同源比对获得hog1基因序列，通过进化树分析表明获得的Hog1与其他丝状真菌的Hog1具有很高的同源性。然后构建了hog1基因的沉默载体并转化灵芝原生质体，获得hog1基因沉默转化子，发现沉默转化子对多种胁迫处理表现出高敏感性，并且hog1基因沉默转化子灵芝三萜含量显著降低，所以我们推测Hog1 MAPK可能在灵芝生长和三萜生物合成中起到重要调控作用。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:灵芝三萜hog1MAPK基因沉默电击转化
目录
引言 4
1 材料与方法 5
1.1 材料 5
1.2 方法 5
2 结果与分析 9
2.1 灵芝hog1的进化分析结果 9
2.2 Hog1基因沉默片段的获取 10
2.3 沉默载体构建，转化及验证 11
2.4 RT-PCR验证结果 12
2.5 沉默转化子的潮霉素抗性验证 13
2.6 灵芝菌丝体平板表型观察 13
2.7 三萜含量检测结果 15
讨论 16
致谢 17
参考文献 18
附录 19
灵芝hog1 MAPK基因的沉默和表型分析
引言
灵芝（Ganoderma lucidum (Leyss. ex. Fr)Karst）属于真菌界（Mycota），真核真菌亚界（Eukaryomycota），真菌门（Eumycota），担子菌亚门（Basidiomycotina），层菌纲（Hymenomycetes），非褶菌目（Aphyllophprates），灵芝菌科（Ganodermataceae），灵芝属（Ganoderma）[1]。灵芝是著名的大型药用真菌，在中国有十分悠久的应用历史。我国有灵芝属真菌20多种，包括赤芝、黄芝、紫芝、黑芝、薄盖灵芝、树舌等。
灵芝是中国传统的扶正固本、滋补强壮中药，《神农本草经》将其列为上品，有“益肺气，益肝气，益脾气”之功效。由于其特殊的药用价值，在现代药物研究中，灵芝有效成分的分析及药理作用研究已引起了国际上的关注，相关工作主要集中在三萜、多糖、一些蛋白质等药用活性成分上。三萜类化合物作为灵芝的主要药用成分之一，具有镇静、抗氧化、抗病毒 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
、降血压和抗肿瘤等活性，其含量的高低是目前衡量灵芝质量的重要指标，三萜类物质是灵芝的次级代谢产物，通过甲羟戊酸途径合成[2]。通过研究对灵芝三萜合成起调控作用的基因，了解其机理，对提高灵芝药用成分含量无疑将大有帮助。
真核生物细胞能通过反应快速、高度复杂的信号转导途径来感知并应对外界环境变化。MAPK 级联途径是一类十分重要信号转导途径，它能把一种胞外输入信号转变为多种输出信号，引起细胞相应反应[3]。MAPK途径能被环境信号、激素、生长因子、细胞因子激活，在生物体中能调节生长、形态建成、繁殖和应激反应，但调节不同的生理反应需要不同的MAPK途径[4]。而MAPK途径又是高度保守的，都包括MAPK，MAPKK(MAPK kinase)，MAPKKK(MAPK kinase kinase)。MAPKKK 被上游感应蛋白磷酸化从而激活MAPKK，而活化的MAPKK 又能使MAPK磷酸化并具有活性，激活的MAPK可以通过磷酸化转录因子、细胞骨架相关蛋白和多种酶类调节各种生理反应。酿酒酵母中已发现有5 种MAPK途径，参与不同的信号转导[3 ]。Hog1 MAPK途径是其中一种，能调节高渗应激信号转导。
Hog1 MAPK途径也包括三级激酶级联系统MAPKKK(Ssk2，Ssk22，Ste11)→ MAPKK(Pbs2)→MAPK(Hog1)。在三级激酶级联系统的上游有两个感应渗透信号的分支：SLN1 和SHO1 ，它们把信号传递给三级激酶系统，通过级联激活最终激活Hog1并通过转录因子参与基因转录调控或进行其他细胞调节。而Hog1 又受酪氨酸蛋白磷酸酯酶PTP(Ptp2，Ptp3)和2C 型丝氨酸- 苏氨酸蛋白磷酸酯酶PTC(Ptc1，Ptc2，Ptc3)负调节，从而反馈调控Hog1 MAPK途径[5]。
Hog1 基因在灵芝中同样存在，但其功能尚未有报道，本文希望了解Hog1在灵芝三萜生物合成和生长中的作用。为此我们先通过同源比对获得灵芝Hog 1基因cDNA序列，通过生物信息学手段对灵芝Hog1进行结构域分析和进化树分析，再运用RNA干扰技术对Hog1进行基因沉默，获得Hog1沉默转化子，最后对沉默转化子进行表型分析和三萜含量分析。这样更有利于从分子水平上了解灵芝的三萜生物合成调节机制，提高灵芝的药用价值。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒
灵芝（Ganoderma lucidum G20）、大肠杆菌DH5α为本实验室保存，pMD-18T vector购自大连Takara公司，pM4i质粒为本实验室保存。
1.1.2 酶和试剂
Taq DNA polymerase、pfu DNA polymerase、dNTP、限制性核酸内切酶（KpnI、SpeI等）、T4 DNA ligase购自Takara公司；DNA Ladder购自GENEray公司；氨苄青霉素、卡那霉素等抗生素均购自上海生工生物工程公司；酵母提取物、胰蛋白胨购自台湾MDbio公司；引物由上海生物工程有限公司合成，其它常规试剂均为分析纯。
1.1.3 相关仪器和设备
凝胶成像系统为Tanon GIS-2500购于上海天能科技有限公司；PCR扩增仪Applied Biosystems 2720购于ABI公司； *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
722可见分光光度仪购于上海菁华科技仪器公司；TG16-W微量高速离心机购于湘仪公司；核酸电泳仪、电泳槽及相关胶板购自北京六一仪器厂。
1.1.4 菌株培养
灵芝菌株在马铃薯葡萄糖培养基（PDB）中，150 r/min，28℃培养6天，斜面菌株4℃保存。大肠杆菌DH5α在LB培养基上37℃培养，菌株在含有20％甘油的LB培养基中-70℃保存，电击缓冲液及培养基配制见附录。
1.2 方法
1.2.1 灵芝hog1基因序列的获得
由于灵芝的研究比较少，所以其的hog1基因序列之前还没有报告，但是灵芝的基因组序列已知，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）等其他真菌的hog1基因序列已知，所以采用酿酒酵母的hog1基因序列比对灵芝的基因组从而得到灵芝的hog1基因序列。具体方法为：通过查找文献获得MAPK信号传导途径研究得相对较深入的一系列真菌（如酿酒酵母）的hog1基因的序列，将它们的hog1基因的序列在灵芝基因组数据库（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中与灵芝基因组进行比对，筛选获得与酵母等真菌的hog1序列同源的基因，然后与其他真菌的hog1蛋白序列进行比对，找出保守的结构域，并通过mega4.0[6]构建系统进化树，对获得的灵芝hog1基因进行系统进化分析。
1.2.2 hog1 基因沉默片段的获得
1.2.2.1 从灵芝菌丝体提取总RNA
① 样品裂解：取灵芝菌丝50~100 mg置于研钵，加液氮快速研成粉末。在液氮完全挥发前，取10~20 mg移入已加入800μL RNA iso plus的离心管中，立即剧烈振荡摇匀。
② 室温静置5 min，12000 rpm，4°C，离心5 min。
③ 吸取上清移入新离心管中，加入1/5体积（140-150μL）氯仿，剧烈振荡15s以混匀，室温放置5min，12000 rpm，4°C，离心15 min，分为三层。
摘要：灵芝是一种重要的药用真菌，其次级代谢产物灵芝三萜是其主要药用成分之一。前人研究表明，灵芝Hog1 MAPK可能在灵芝的次级代谢和细胞凋亡过程中起重要调控作用，但目前相关作用机制还不清楚，本文旨在探究hog1 MAPK在灵芝生长和三萜合成中的作用。首先根据同源比对获得hog1基因序列，通过进化树分析表明获得的Hog1与其他丝状真菌的Hog1具有很高的同源性。然后构建了hog1基因的沉默载体并转化灵芝原生质体，获得hog1基因沉默转化子，发现沉默转化子对多种胁迫处理表现出高敏感性，并且hog1基因沉默转化子灵芝三萜含量显著降低，所以我们推测Hog1 MAPK可能在灵芝生长和三萜生物合成中起到重要调控作用。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:灵芝三萜hog1MAPK基因沉默电击转化
目录
引言 4
1 材料与方法 5
1.1 材料 5
1.2 方法 5
2 结果与分析 9
2.1 灵芝hog1的进化分析结果 9
2.2 Hog1基因沉默片段的获取 10
2.3 沉默载体构建，转化及验证 11
2.4 RT-PCR验证结果 12
2.5 沉默转化子的潮霉素抗性验证 13
2.6 灵芝菌丝体平板表型观察 13
2.7 三萜含量检测结果 15
讨论 16
致谢 17
参考文献 18
附录 19
灵芝hog1 MAPK基因的沉默和表型分析
引言
灵芝（Ganoderma lucidum (Leyss. ex. Fr)Karst）属于真菌界（Mycota），真核真菌亚界（Eukaryomycota），真菌门（Eumycota），担子菌亚门（Basidiomycotina），层菌纲（Hymenomycetes），非褶菌目（Aphyllophprates），灵芝菌科（Ganodermataceae），灵芝属（Ganoderma）[1]。灵芝是著名的大型药用真菌，在中国有十分悠久的应用历史。我国有灵芝属真菌20多种，包括赤芝、黄芝、紫芝、黑芝、薄盖灵芝、树舌等。
灵芝是中国传统的扶正固本、滋补强壮中药，《神农本草经》将其列为上品，有“益肺气，益肝气，益脾气”之功效。由于其特殊的药用价值，在现代药物研究中，灵芝有效成分的分析及药理作用研究已引起了国际上的关注，相关工作主要集中在三萜、多糖、一些蛋白质等药用活性成分上。三萜类化合物作为灵芝的主要药用成分之一，具有镇静、抗氧化、抗病毒 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
、降血压和抗肿瘤等活性，其含量的高低是目前衡量灵芝质量的重要指标，三萜类物质是灵芝的次级代谢产物，通过甲羟戊酸途径合成[2]。通过研究对灵芝三萜合成起调控作用的基因，了解其机理，对提高灵芝药用成分含量无疑将大有帮助。
真核生物细胞能通过反应快速、高度复杂的信号转导途径来感知并应对外界环境变化。MAPK 级联途径是一类十分重要信号转导途径，它能把一种胞外输入信号转变为多种输出信号，引起细胞相应反应[3]。MAPK途径能被环境信号、激素、生长因子、细胞因子激活，在生物体中能调节生长、形态建成、繁殖和应激反应，但调节不同的生理反应需要不同的MAPK途径[4]。而MAPK途径又是高度保守的，都包括MAPK，MAPKK(MAPK kinase)，MAPKKK(MAPK kinase kinase)。MAPKKK 被上游感应蛋白磷酸化从而激活MAPKK，而活化的MAPKK 又能使MAPK磷酸化并具有活性，激活的MAPK可以通过磷酸化转录因子、细胞骨架相关蛋白和多种酶类调节各种生理反应。酿酒酵母中已发现有5 种MAPK途径，参与不同的信号转导[3 ]。Hog1 MAPK途径是其中一种，能调节高渗应激信号转导。
Hog1 MAPK途径也包括三级激酶级联系统MAPKKK(Ssk2，Ssk22，Ste11)→ MAPKK(Pbs2)→MAPK(Hog1)。在三级激酶级联系统的上游有两个感应渗透信号的分支：SLN1 和SHO1 ，它们把信号传递给三级激酶系统，通过级联激活最终激活Hog1并通过转录因子参与基因转录调控或进行其他细胞调节。而Hog1 又受酪氨酸蛋白磷酸酯酶PTP(Ptp2，Ptp3)和2C 型丝氨酸- 苏氨酸蛋白磷酸酯酶PTC(Ptc1，Ptc2，Ptc3)负调节，从而反馈调控Hog1 MAPK途径[5]。
Hog1 基因在灵芝中同样存在，但其功能尚未有报道，本文希望了解Hog1在灵芝三萜生物合成和生长中的作用。为此我们先通过同源比对获得灵芝Hog 1基因cDNA序列，通过生物信息学手段对灵芝Hog1进行结构域分析和进化树分析，再运用RNA干扰技术对Hog1进行基因沉默，获得Hog1沉默转化子，最后对沉默转化子进行表型分析和三萜含量分析。这样更有利于从分子水平上了解灵芝的三萜生物合成调节机制，提高灵芝的药用价值。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒
灵芝（Ganoderma lucidum G20）、大肠杆菌DH5α为本实验室保存，pMD-18T vector购自大连Takara公司，pM4i质粒为本实验室保存。
1.1.2 酶和试剂
Taq DNA polymerase、pfu DNA polymerase、dNTP、限制性核酸内切酶（KpnI、SpeI等）、T4 DNA ligase购自Takara公司；DNA Ladder购自GENEray公司；氨苄青霉素、卡那霉素等抗生素均购自上海生工生物工程公司；酵母提取物、胰蛋白胨购自台湾MDbio公司；引物由上海生物工程有限公司合成，其它常规试剂均为分析纯。
1.1.3 相关仪器和设备
凝胶成像系统为Tanon GIS-2500购于上海天能科技有限公司；PCR扩增仪Applied Biosystems 2720购于ABI公司； *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
722可见分光光度仪购于上海菁华科技仪器公司；TG16-W微量高速离心机购于湘仪公司；核酸电泳仪、电泳槽及相关胶板购自北京六一仪器厂。
1.1.4 菌株培养
灵芝菌株在马铃薯葡萄糖培养基（PDB）中，150 r/min，28℃培养6天，斜面菌株4℃保存。大肠杆菌DH5α在LB培养基上37℃培养，菌株在含有20％甘油的LB培养基中-70℃保存，电击缓冲液及培养基配制见附录。
1.2 方法
1.2.1 灵芝hog1基因序列的获得
由于灵芝的研究比较少，所以其的hog1基因序列之前还没有报告，但是灵芝的基因组序列已知，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）等其他真菌的hog1基因序列已知，所以采用酿酒酵母的hog1基因序列比对灵芝的基因组从而得到灵芝的hog1基因序列。具体方法为：通过查找文献获得MAPK信号传导途径研究得相对较深入的一系列真菌（如酿酒酵母）的hog1基因的序列，将它们的hog1基因的序列在灵芝基因组数据库（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中与灵芝基因组进行比对，筛选获得与酵母等真菌的hog1序列同源的基因，然后与其他真菌的hog1蛋白序列进行比对，找出保守的结构域，并通过mega4.0[6]构建系统进化树，对获得的灵芝hog1基因进行系统进化分析。
1.2.2 hog1 基因沉默片段的获得
1.2.2.1 从灵芝菌丝体提取总RNA
① 样品裂解：取灵芝菌丝50~100 mg置于研钵，加液氮快速研成粉末。在液氮完全挥发前，取10~20 mg移入已加入800μL RNA iso plus的离心管中，立即剧烈振荡摇匀。
② 室温静置5 min，12000 rpm，4°C，离心5 min。
③ 吸取上清移入新离心管中，加入1/5体积（140-150μL）氯仿，剧烈振荡15s以混匀，室温放置5min，12000 rpm，4°C，离心15 min，分为三层。
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