宿主对齐整小核菌菌株sc64防御机制的初步探索
随着公众健康和环保意识的提高以及现代有机农业的快速发展，生物除草剂的开发越来越受到关注。本实验室前期研究中发现的齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)（编号SC64）对多种杂草均有致病性，可以作为良好的生物除草剂进行开发。但目前对其致病机制和宿主响应防御机制尚未研究清楚。本研究采用模式植物拟南芥为植物材料，探索其受到齐整小核菌侵染后的防御机制。选用实验室现有的典型拟南芥种群（4号种群）。利用菌株SC64侵染拟南芥叶片不同时间（6h，12h，18h，24h，36h）后，检测免疫通路关键基因转录水平的变化，以及考察茎秆木质素化程度的改变。最终通过病原菌刺激后，拟南芥不同免疫通路的应答情况以及茎秆木质素化程度的变化，多角度阐述SC64侵染引起的寄主免疫机制。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1 材料4
1．1培养拟南芥4
1．2培养齐整小核菌菌株SC644
1．3齐整小核菌侵染拟南芥叶片4
1．3．1齐整小核菌侵染拟南芥叶片后叶绿素荧光检测实验4
1．3．2齐整小核菌侵染拟南芥叶片后测定免疫通路相关基因表达量实验4
1．3．3齐整小核菌侵染拟南芥后茎秆组织学木质素化研究实验4
1．4不同生长时期拟南芥茎秆组织学木质素化研究实验4
2 实验方法4
2．1 齐整小核菌侵染拟南芥叶片后测定免疫通路相关基因表达量实验4
2．1．1磨样4
2．1．2提取RNA4
2．1．3反转cDNA5
2．1．4测定拟南芥免疫通路相关基因表达量6
2．2茎秆组织学木质素化研究实验6
2．2．1Malue 组织染色法 6
2．2．2Fasga 组织染色法 6
2．2．3Phoroglucinol组织染色法6
3 结果7
3．1齐整小核菌侵染拟南芥叶片后叶绿素荧光检测结果7
3．2齐整小核菌侵染拟南芥叶片不同时间后免疫相关基因的表达量7
3．3不同时期拟南芥茎 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
秆组织学木质素化研究实验9
3．4不同侵染时间拟南芥茎秆组织学木质素化研究实验12
4 讨论18
致谢19
参考文献19
宿主对齐整小核菌菌株SC64防御机制的初步探索
引言
引言
目前杂草生物防治方面最活跃的领域就是生物除草剂（Bioherbicide）的研究，它是指在人为控制的条件下，选用能杀灭杂草的天敌，进行人工培养繁殖后获得的大剂量生物制剂（强胜，2007）。从狭义上讲，是指直接利用动物、植物、微生物产生的天然活性物质或生物本身作为除草剂；从广义上来说，不仅是指直接利用天然活性物质或生物本身作为除草剂，还包括根据天然活性物质的化学结构或类似衍生结构人工合成的除草剂。依据其活性物质来源，将生物除草剂划分为3种，即植物源、动物源和微生物源除草剂（刘爱群，2013）。而目前的研究与应用对象，未见报道动物源除草剂，报道的植物源除草剂也很少，主要集中在微生物源除草剂上（李建，2016）。
微生物除草剂是指在人为控制条件下，能有效防除特定杂草的活体微生物产品或微生物代谢产物。微生物除草剂又分为利用活体微生物除草和利用微生物产生的代谢产物来防除杂草两类（Kremer et al．，2005）。微生物除草剂有两大特点优势，一是能够通过人工培养生产获得大批量的接种体；另一是能够快速侵染杂草，并在较短时间内杀死宿主——称之为“淹没式应用”（刘占山，2007）。自20世纪60年代，国外就开始了微生物除草剂的研究（仉欢 等，2010）。1981年，第一个生物除草剂DeVine在美国登记注册（Kenney，1986），该生物除草剂是美国佛罗里达州的棕榈疫霉（Phytophoro PALmivora）致病菌株的厚垣孢子悬浮剂，被广泛用于防除危害柑橘园的恶性杂草莫伦藤（Morrenia ordorata），防效可达90%以上，且药效可持续2年。中国的生物除草剂的研制始于60年代的“鲁保1号”，是由山东省农科院植保所从感病的南方菟丝子（Cuscuta australis）上分离得到的盘长孢状菟丝子专化型（Colletorichum gloeosporiodes Penz Sacc f．sp． cuscutae）菌株，用于防除大豆田杂草菟丝子，直接防效达70%~90%（杨恒友 等，2010）。
1891年美国佛罗里达州首次报道了番茄白绢病，常称南方枯萎病。白绢病病原菌的无性阶段命名为S．rolfsii Sacc．，在我国魏景超（1979）将其归为小菌核菌属罗氏白绢小菌核菌，戴芳澜（1979）则称之为齐整小核菌，而其有性阶段现在为大多数人所接受的是Athelia rolfsii（Curiz）Tu&Kimbrough，称罗氏阿太菌，属担子菌亚门真菌（Punja et al．，1982），2008年出版的《真菌词典》第10版分类系统将其归入担子菌门，伞菌纲，多孔菌目（贺新生，2009）。此菌一般不产生有性世代，无性世代也不产生任何孢子，仅形成大小如油菜粒的褐色至暗褐色的球形菌核，菌核由外壳、表皮层及菌髓层构成（Singleton et al．，1992）。
齐整小核菌腐生性较强，寄主范围广，能侵害作物、花卉、农林植物等多种植物。目前已发现62科的超过500种寄主植物（Aycock，1996；Punja，1988；Cilliers et al．，2000），且新的寄主仍在不断的报道。高温高湿气候利于该菌核萌发和菌丝生长，因此该菌主要分布在热带和亚热带地区（Yorinori，1994）。所报道的寄主中主要集中在双子叶植物科，而部分报道显示，该菌还可以引起单子叶植物病害（Mordue，1974b）。 拟南芥作为模式植物有以下等优势：植株小，可大批量在温室中培养，也可在培养皿中生长；生活周期短，周期只需68周时间；自体受精；每株可产生的种子数量多；己完成了基因组全序列测定；其基因组是目前己知高等植物中最小的。因此，植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究常常以拟南芥为实验材料。
1 材料
1．1培养拟南芥
于25℃条件培养4盆拟南芥4周，每盆28株拟南芥。
1．2培养齐整小核菌菌株SC64
使用马铃薯蔗糖琼脂（PotatoSaccharoseAgar，PSA）培养基平板培养齐整小核菌（Sclerotium rolfsii，SC64）。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1 材料4
1．1培养拟南芥4
1．2培养齐整小核菌菌株SC644
1．3齐整小核菌侵染拟南芥叶片4
1．3．1齐整小核菌侵染拟南芥叶片后叶绿素荧光检测实验4
1．3．2齐整小核菌侵染拟南芥叶片后测定免疫通路相关基因表达量实验4
1．3．3齐整小核菌侵染拟南芥后茎秆组织学木质素化研究实验4
1．4不同生长时期拟南芥茎秆组织学木质素化研究实验4
2 实验方法4
2．1 齐整小核菌侵染拟南芥叶片后测定免疫通路相关基因表达量实验4
2．1．1磨样4
2．1．2提取RNA4
2．1．3反转cDNA5
2．1．4测定拟南芥免疫通路相关基因表达量6
2．2茎秆组织学木质素化研究实验6
2．2．1Malue 组织染色法 6
2．2．2Fasga 组织染色法 6
2．2．3Phoroglucinol组织染色法6
3 结果7
3．1齐整小核菌侵染拟南芥叶片后叶绿素荧光检测结果7
3．2齐整小核菌侵染拟南芥叶片不同时间后免疫相关基因的表达量7
3．3不同时期拟南芥茎 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
秆组织学木质素化研究实验9
3．4不同侵染时间拟南芥茎秆组织学木质素化研究实验12
4 讨论18
致谢19
参考文献19
宿主对齐整小核菌菌株SC64防御机制的初步探索
引言
引言
目前杂草生物防治方面最活跃的领域就是生物除草剂（Bioherbicide）的研究，它是指在人为控制的条件下，选用能杀灭杂草的天敌，进行人工培养繁殖后获得的大剂量生物制剂（强胜，2007）。从狭义上讲，是指直接利用动物、植物、微生物产生的天然活性物质或生物本身作为除草剂；从广义上来说，不仅是指直接利用天然活性物质或生物本身作为除草剂，还包括根据天然活性物质的化学结构或类似衍生结构人工合成的除草剂。依据其活性物质来源，将生物除草剂划分为3种，即植物源、动物源和微生物源除草剂（刘爱群，2013）。而目前的研究与应用对象，未见报道动物源除草剂，报道的植物源除草剂也很少，主要集中在微生物源除草剂上（李建，2016）。
微生物除草剂是指在人为控制条件下，能有效防除特定杂草的活体微生物产品或微生物代谢产物。微生物除草剂又分为利用活体微生物除草和利用微生物产生的代谢产物来防除杂草两类（Kremer et al．，2005）。微生物除草剂有两大特点优势，一是能够通过人工培养生产获得大批量的接种体；另一是能够快速侵染杂草，并在较短时间内杀死宿主——称之为“淹没式应用”（刘占山，2007）。自20世纪60年代，国外就开始了微生物除草剂的研究（仉欢 等，2010）。1981年，第一个生物除草剂DeVine在美国登记注册（Kenney，1986），该生物除草剂是美国佛罗里达州的棕榈疫霉（Phytophoro PALmivora）致病菌株的厚垣孢子悬浮剂，被广泛用于防除危害柑橘园的恶性杂草莫伦藤（Morrenia ordorata），防效可达90%以上，且药效可持续2年。中国的生物除草剂的研制始于60年代的“鲁保1号”，是由山东省农科院植保所从感病的南方菟丝子（Cuscuta australis）上分离得到的盘长孢状菟丝子专化型（Colletorichum gloeosporiodes Penz Sacc f．sp． cuscutae）菌株，用于防除大豆田杂草菟丝子，直接防效达70%~90%（杨恒友 等，2010）。
1891年美国佛罗里达州首次报道了番茄白绢病，常称南方枯萎病。白绢病病原菌的无性阶段命名为S．rolfsii Sacc．，在我国魏景超（1979）将其归为小菌核菌属罗氏白绢小菌核菌，戴芳澜（1979）则称之为齐整小核菌，而其有性阶段现在为大多数人所接受的是Athelia rolfsii（Curiz）Tu&Kimbrough，称罗氏阿太菌，属担子菌亚门真菌（Punja et al．，1982），2008年出版的《真菌词典》第10版分类系统将其归入担子菌门，伞菌纲，多孔菌目（贺新生，2009）。此菌一般不产生有性世代，无性世代也不产生任何孢子，仅形成大小如油菜粒的褐色至暗褐色的球形菌核，菌核由外壳、表皮层及菌髓层构成（Singleton et al．，1992）。
齐整小核菌腐生性较强，寄主范围广，能侵害作物、花卉、农林植物等多种植物。目前已发现62科的超过500种寄主植物（Aycock，1996；Punja，1988；Cilliers et al．，2000），且新的寄主仍在不断的报道。高温高湿气候利于该菌核萌发和菌丝生长，因此该菌主要分布在热带和亚热带地区（Yorinori，1994）。所报道的寄主中主要集中在双子叶植物科，而部分报道显示，该菌还可以引起单子叶植物病害（Mordue，1974b）。 拟南芥作为模式植物有以下等优势：植株小，可大批量在温室中培养，也可在培养皿中生长；生活周期短，周期只需68周时间；自体受精；每株可产生的种子数量多；己完成了基因组全序列测定；其基因组是目前己知高等植物中最小的。因此，植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究常常以拟南芥为实验材料。
1 材料
1．1培养拟南芥
于25℃条件培养4盆拟南芥4周，每盆28株拟南芥。
1．2培养齐整小核菌菌株SC64
使用马铃薯蔗糖琼脂（PotatoSaccharoseAgar，PSA）培养基平板培养齐整小核菌（Sclerotium rolfsii，SC64）。
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