转录组测序的凤阳麝香霉vocs抑制自身生长机制研究
凤阳麝香霉是一种新发现的能产生具有强烈抗菌活性的挥发性有机化合物（VOCs）的一类内生真菌，在农业和环境保护等领域有很大的应用前景。但其产生的VOCs会抑制其自身生长，且该抑制机制尚不明确，不利于相关生物制剂的开发和生产。转录组测序是研究基因表达调控机制的一种重要的研究手段。本课题采用转录组测序技术，通过提取出活性炭吸附（无VOCs）条件下和野生（有VOCs）条件下凤阳麝香霉的总RNA并进行高通量测序，使用生物信息学软件和数据库来分析测序获得的数据，发现VOCs引起麝香霉DNA甲基化水平的改变，并且可能影响了麝香霉的金属离子跨膜运输。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法4
1.1 实验材料 4
1.1.1 供试菌株4
1.1.2 培养基4
1.1.3 试剂4
1.1.4 仪器4
1.2 实验方法 4
1.2．1 菌株的活化培养和保存4
1.2.2 活性炭吸附的对峙培养5
1.2.3 总RNA的提取5
1.2.4 转录组测序5
1.2.5 转录组数据处理分析6
2 结果与分析6
2.1 总RNA的提取6
2.2 转录组测序结果7
2.3 表达差异基因的功能分析14
2.3.1 与氨基酸代谢相关基因 14
2.3.2 与VOCs代谢相关基因 15
3 讨论16
3.1 本实验存在的问题16
3.2 本实验展望16
致谢17
参考文献17
基于转录组测序的凤阳麝香霉VOCs抑制自身生长机制研究
生命基地 秦宇
引言
引言 凤阳麝香霉Muscodor fengyangensis是从我国浙江凤阳山自然保护区的树木上获得的一种新的内生真菌，是麝香霉属Muscodor的一个新种（Zhang等，2010）。该属的真菌均可以产生特异性的挥发性有机化合物（volatile *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
organic compounds, VOCs），VOCs具有强烈的抗菌活性，能抑制许多植物和人的病原细菌、真菌以及昆虫的生长，甚至将其杀死（Strobel等，2001；Zhang等，2010）。基于此特性，其在农业和环境保护上有很大的应用前景，可以应用在水果保鲜、防腐，以及种子病害处理和土壤病害防治方面（Gabler等，2010；Goates等，2011）。在美国已经有两种麝香霉菌株在EPA（Environmental Protection Agency）成功注册。但是，由麝香霉产生的VOCs也会抑制其自身生长，使用活性炭吸附VOCs后，麝香霉的生长速度加快（张雪，2015），该抑制机制尚不明确，不利于相关生物制剂的开发和生产。在对麝香霉源的VOCs的相关研究中，对于其化学成分构成的研究较多，采用GCMS等技术基本确定了麝香霉VOCs的组分，并发现：不同种的麝香霉菌株所产生的VOCs的化学组成成分不尽相同，并且成分十分复杂，主要包括多种的醇、酸、酯、酮和亲脂性的化合物。而对于凤阳麝香霉来说，萘的一种相对分子质量为204的衍生物是凤阳麝香霉的VOCs的主要成分（Zhang等，2010）。但对于VOCs的抑制分子机理研究很少。Alpha et al.（2015）通过一系列遗传筛选和生化测定研究发现白色麝香霉产生的VOCs会导致大肠杆菌DNA发生甲基化，使DNA在复制或转录中发生断裂，同时额外的细胞毒性分析显示VOCs会增加细胞膜的流动性使大肠杆菌裂解；Hutchings et al. （2017）通过实验认为N甲基N亚硝基异丁酰胺（NmethylNnitrosoisobutyramide）是麝香霉属VOCs的主要抑菌成分，这是一种DNA甲基化剂，但在其研究中发现麝香霉属真菌对DNA甲基化表现出很高的抗性，故DNA甲基化是否是麝香霉抑制自身生长的主要因素仍不能确定。
转录组测序技术，是通过分析生物体转录组的差异，了解到在特定生长条件下的生物个体或群落中基因的表达水平和不同基因间的表达差异，进而理解基因的表达调控机制，其在基因表达调控研究中得到了十分广泛应用。卢坤等（2015）通过采用RNASeq技术鉴定出甘蓝型油菜叶片干旱胁迫的应答基因Bra005501、Bra022936和Bol037013，并发现了与植物病原菌防御反应有关基因的表达下调，解释了长时间非生物胁迫会增加其非生物胁迫敏感性，降低对病原菌的防御能力的分子机制；Kakumanu A et al. （2012）通过对干旱胁迫下玉米的子房和叶片进行转录组组测序，说明ABA信号转导基因仅对子房干旱有响应，揭示了干旱胁迫对玉米子房影响主要发生在胚胎发育的最早期的机制。Castrillo et al.（2017）通过对野生型和PHR1敲除型的拟南芥与伴生细菌群落（SynCom）定植后RNAseq分析得出，PHR1基因在拟南芥的磷酸盐饥饿反应和抑制微生物驱动的植物免疫反应中有重要的作用。
本课题采用转录组测序技术，通过提取出活性炭吸附（无VOCs）条件下和野生（有VOCs）条件下凤阳麝香霉的总RNA并进行高通量测序，使用生物信息学软件和数据库分析测序获得的数据，鉴别出差异表达基因，进而获得凤阳麝香霉产生VOCs对自身抑制的可能靶基因，为麝香霉菌株进行改良，构建VOCs高产工程菌株奠定基础。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 供试菌株
凤阳麝香霉 ZJLQ024
1．1．2 培养基
Potato Dextrose Agar（PDA培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基)：去皮马铃薯 200g、Dglucose 20g、Agar 15g、蒸馏水1000mL。
取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000毫升煮沸至玻璃棒轻松戳穿，8层纱布滤去马铃薯块，冷却后将滤液补足至1000毫升，加葡萄糖20克，三角瓶装1.5%的琼脂，加入液体，纱布和报纸封口后，121℃高压灭菌15min。
液体冷冻保存培养基：葡萄糖 10g、酵母提取物 1g、酶解酪蛋白 0.5g、酸解酪蛋白 0.5g、甘油 180mL、去离子水。
蒸馏水先将葡萄糖、酵母提取物、酶解酪蛋白、酸解酪蛋白溶解后，之后再加入甘油，用蒸馏水定容至1000mL，121℃高压灭菌15min。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法4
1.1 实验材料 4
1.1.1 供试菌株4
1.1.2 培养基4
1.1.3 试剂4
1.1.4 仪器4
1.2 实验方法 4
1.2．1 菌株的活化培养和保存4
1.2.2 活性炭吸附的对峙培养5
1.2.3 总RNA的提取5
1.2.4 转录组测序5
1.2.5 转录组数据处理分析6
2 结果与分析6
2.1 总RNA的提取6
2.2 转录组测序结果7
2.3 表达差异基因的功能分析14
2.3.1 与氨基酸代谢相关基因 14
2.3.2 与VOCs代谢相关基因 15
3 讨论16
3.1 本实验存在的问题16
3.2 本实验展望16
致谢17
参考文献17
基于转录组测序的凤阳麝香霉VOCs抑制自身生长机制研究
生命基地 秦宇
引言
引言 凤阳麝香霉Muscodor fengyangensis是从我国浙江凤阳山自然保护区的树木上获得的一种新的内生真菌，是麝香霉属Muscodor的一个新种（Zhang等，2010）。该属的真菌均可以产生特异性的挥发性有机化合物（volatile *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
organic compounds, VOCs），VOCs具有强烈的抗菌活性，能抑制许多植物和人的病原细菌、真菌以及昆虫的生长，甚至将其杀死（Strobel等，2001；Zhang等，2010）。基于此特性，其在农业和环境保护上有很大的应用前景，可以应用在水果保鲜、防腐，以及种子病害处理和土壤病害防治方面（Gabler等，2010；Goates等，2011）。在美国已经有两种麝香霉菌株在EPA（Environmental Protection Agency）成功注册。但是，由麝香霉产生的VOCs也会抑制其自身生长，使用活性炭吸附VOCs后，麝香霉的生长速度加快（张雪，2015），该抑制机制尚不明确，不利于相关生物制剂的开发和生产。在对麝香霉源的VOCs的相关研究中，对于其化学成分构成的研究较多，采用GCMS等技术基本确定了麝香霉VOCs的组分，并发现：不同种的麝香霉菌株所产生的VOCs的化学组成成分不尽相同，并且成分十分复杂，主要包括多种的醇、酸、酯、酮和亲脂性的化合物。而对于凤阳麝香霉来说，萘的一种相对分子质量为204的衍生物是凤阳麝香霉的VOCs的主要成分（Zhang等，2010）。但对于VOCs的抑制分子机理研究很少。Alpha et al.（2015）通过一系列遗传筛选和生化测定研究发现白色麝香霉产生的VOCs会导致大肠杆菌DNA发生甲基化，使DNA在复制或转录中发生断裂，同时额外的细胞毒性分析显示VOCs会增加细胞膜的流动性使大肠杆菌裂解；Hutchings et al. （2017）通过实验认为N甲基N亚硝基异丁酰胺（NmethylNnitrosoisobutyramide）是麝香霉属VOCs的主要抑菌成分，这是一种DNA甲基化剂，但在其研究中发现麝香霉属真菌对DNA甲基化表现出很高的抗性，故DNA甲基化是否是麝香霉抑制自身生长的主要因素仍不能确定。
转录组测序技术，是通过分析生物体转录组的差异，了解到在特定生长条件下的生物个体或群落中基因的表达水平和不同基因间的表达差异，进而理解基因的表达调控机制，其在基因表达调控研究中得到了十分广泛应用。卢坤等（2015）通过采用RNASeq技术鉴定出甘蓝型油菜叶片干旱胁迫的应答基因Bra005501、Bra022936和Bol037013，并发现了与植物病原菌防御反应有关基因的表达下调，解释了长时间非生物胁迫会增加其非生物胁迫敏感性，降低对病原菌的防御能力的分子机制；Kakumanu A et al. （2012）通过对干旱胁迫下玉米的子房和叶片进行转录组组测序，说明ABA信号转导基因仅对子房干旱有响应，揭示了干旱胁迫对玉米子房影响主要发生在胚胎发育的最早期的机制。Castrillo et al.（2017）通过对野生型和PHR1敲除型的拟南芥与伴生细菌群落（SynCom）定植后RNAseq分析得出，PHR1基因在拟南芥的磷酸盐饥饿反应和抑制微生物驱动的植物免疫反应中有重要的作用。
本课题采用转录组测序技术，通过提取出活性炭吸附（无VOCs）条件下和野生（有VOCs）条件下凤阳麝香霉的总RNA并进行高通量测序，使用生物信息学软件和数据库分析测序获得的数据，鉴别出差异表达基因，进而获得凤阳麝香霉产生VOCs对自身抑制的可能靶基因，为麝香霉菌株进行改良，构建VOCs高产工程菌株奠定基础。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 供试菌株
凤阳麝香霉 ZJLQ024
1．1．2 培养基
Potato Dextrose Agar（PDA培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基)：去皮马铃薯 200g、Dglucose 20g、Agar 15g、蒸馏水1000mL。
取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000毫升煮沸至玻璃棒轻松戳穿，8层纱布滤去马铃薯块，冷却后将滤液补足至1000毫升，加葡萄糖20克，三角瓶装1.5%的琼脂，加入液体，纱布和报纸封口后，121℃高压灭菌15min。
液体冷冻保存培养基：葡萄糖 10g、酵母提取物 1g、酶解酪蛋白 0.5g、酸解酪蛋白 0.5g、甘油 180mL、去离子水。
蒸馏水先将葡萄糖、酵母提取物、酶解酪蛋白、酸解酪蛋白溶解后，之后再加入甘油，用蒸馏水定容至1000mL，121℃高压灭菌15min。
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