灵芝bzip转录因子对灵芝生长发育及次生代谢的影响
摘 要碱性亮氨酸拉链（basic Leucine Zipper, bZIP）类转录因子是最古老广泛的真核生物转录因子家族，存在于所有真核生物中。不同bZIP家族成员在功能上既有互补，同时存在差异。在真菌中，bZIP蛋白质参与了调节菌丝生长、多种压力胁迫应答等生理活动，但灵芝中bZIP转录因子的功能尚未被系统地解析。本课题系统地筛选出灵芝bZIP家族转录因子，构建了相应的灵芝bZIP沉默菌株并利用其初步研究了灵芝bZIP转录因子GlbZIP02和GlbZIP08在灵芝生长发育、灵芝三萜合成以及热胁迫、氧化胁迫应答中的作用。结果表明，灵芝bZIP转录因子GlbZIP02和GlbZIP08在灵芝生长发育中发挥必要作用，并对灵芝三萜的合成存在负调控。至于GlbZIP02和GlbZIP08基因是否参与调控灵芝对热胁迫以及氧化胁迫的应答，仍需要进一步研究。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1 材料与方法 2
1.1 实验材料 2
1.1.1 菌株、质粒和试剂 2
1.1.2 菌株培养 2
1.1.3 主要仪器 2
1.2 实验方法 3
1.2.1 灵芝bZIP家族转录因子的系统性筛选 3
1.2.2灵芝bZIP家族转录因子基因的生物信息学分析 3
1.2.3 灵芝bZIP家族转录因子沉默质粒的构建 3
1.2.3.1 灵芝bZIP家族基因沉默片段的PCR扩增 3
1.2.3.2 灵芝bZIP家族基因沉默片段的双酶切 3
1.2.3.3 灵芝bZIP家族基因沉默片段琼脂糖纯化回收 4
1.2.3.4 灵芝bZIP家族基因沉默片段和T载体的连接 4
1.2.3.5 大肠杆菌DH5α感受态的制备和转化 4
1.2.3.6 碱裂解法提取pMD18TGlbZIP质粒 5
1.2.3.7 灵芝bZIP家族基因沉默片段和沉默载体的双酶切 5
1.2.3.8 灵芝bZIP家族基因沉默片段和沉默载体酶切片段的琼脂糖纯化回收 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
5
1.2.3.9 灵芝bZIP家族基因沉默片段和沉默载体酶切片段的连接 5
1.2.3.10 大肠杆菌感受态转化 5
1.2.3.11 碱裂解法提取pmiGlbZIP质粒 5
1.2.4 灵芝bZIP家族转录因子沉默转化子的转化及筛选 6
1.2.4.1 灵芝原生质体的制备及脂质体转化 6
1.2.4.2 灵芝bZIP转录因子沉默转化子沉默效率验证 6
1.2.5 灵芝bZIP家族转录因子沉默转化子灵芝三萜含量的测定 7
1.2.5.1 灵芝菌丝球的培养 7
1.2.5.2 分光光度计法测定三萜含量 8
1.2.6 热胁迫处理方法 8
1.2.7 氧化胁迫处理方法 8
1.2.8 统计方法 8
2 结果与分析 9
2.1 灵芝bZIP家族转录因子的系统性筛选 9
2.2 灵芝bZIP家族转录因子GlbZIP02和GlbZIP08的生物信息学分析 9
2.2.1 灵芝bZIP家族转录因子基因的基本生物学特性 9
2.2.2 灵芝GlbZIP02和GlbZIP08转录因子进化关系及结构域分析 10
2.3 灵芝GlbZIP02基因沉默菌株和GlbZIP08基因沉默菌株的构建 13
2.4 灵芝GlbZIP02和GlbZIP08转录因子对灵芝生长发育及次生代谢的影响 13
2.4.1 灵芝GlbZIP02、GlbZIP08基因沉默影响菌丝生长 13
2.4.2 灵芝GlbZIP02、GlbZIP08基因参与调控灵芝三萜合成 15
2.4.3 灵芝GlbZIP02、GlbZIP08基因参与非生物胁迫应答 16
2.4.3.1 灵芝GlbZIP02、GlbZIP08基因可能参与热胁迫对菌丝生长发育的调控 16
2.4.3.2灵芝GlbZIP02基因可能参与氧化胁迫对菌丝生长发育的调控 17
3 讨论 18
致谢 19
参考文献 19
附录 21
灵芝bZIP转录因子
对灵芝生长发育及次生代谢的影响
引言
灵芝（Ganoderma lucidum）是一种名贵的药用真菌，其主要药用成分为灵芝三萜等次生代谢产物。深入研究灵芝生长发育以及次生代谢的调控机制，能为灵芝的生产技术优化及药用价值开发奠定良好的理论基础，也能为从反式遗传学角度研究其他大型真菌提供参考。
灵芝主要次生代谢产物——灵芝三萜类化合物（又称灵芝酸Ganoderic acid），具有抗氧化、抗病毒、降血压和抗肿瘤等多种生理活性(Shiao 1992, Hajjaj, Mace et al. 2005)，是灵芝主要药用成分之一。灵芝三萜的合成途径已经清晰，其合成调控网络尚未被完全解析。碱性亮氨酸拉链（basic Leucine Zipper, bZIP）类转录因子是最古老广泛的真核生物转录因子家族，存在于所有真核生物中(Niu, RenshawGegg et al. 1999)。系统地研究这些转录因子的特性发现，不同bZIP家族成员在功能上既有互补，同时存在差异。在真菌中，bZIP蛋白质参与了调节菌丝生长、多种压力胁迫应答等生理活动。本实验室前期研究证明，茉莉酸甲酯是一种能显著诱导灵芝三萜生物合成的外源信号。在分析茉莉酸甲酯诱导下灵芝转录组的变化时，发现bZIP家族的转录因子AP1的表达显著上调(Ren, Li et al. 2013)；进一步研究发现灵芝中最典型的bZIP家族转录因子AP1参与了调控菌丝生长发育、细胞内氧化还原平衡、灵芝三萜的生物合成等生理过程。这启发了我们进一步探究灵芝其他bZIP蛋白的潜在功能。
本课题旨在通过系统地筛选灵芝bZIP家族转录因子，利用前期成功构建的灵芝bZIP转录因子沉默菌株GlbZIP02i和GlbZIP08i，初步观测灵芝bZIP家族转录因子GlbZIP02和GlbZIP08在灵芝生长发育、灵芝三萜合成、热胁迫及氧化胁迫应答过程中的潜在调控作用。
1 材料与方法
1.1 实验材料
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1 材料与方法 2
1.1 实验材料 2
1.1.1 菌株、质粒和试剂 2
1.1.2 菌株培养 2
1.1.3 主要仪器 2
1.2 实验方法 3
1.2.1 灵芝bZIP家族转录因子的系统性筛选 3
1.2.2灵芝bZIP家族转录因子基因的生物信息学分析 3
1.2.3 灵芝bZIP家族转录因子沉默质粒的构建 3
1.2.3.1 灵芝bZIP家族基因沉默片段的PCR扩增 3
1.2.3.2 灵芝bZIP家族基因沉默片段的双酶切 3
1.2.3.3 灵芝bZIP家族基因沉默片段琼脂糖纯化回收 4
1.2.3.4 灵芝bZIP家族基因沉默片段和T载体的连接 4
1.2.3.5 大肠杆菌DH5α感受态的制备和转化 4
1.2.3.6 碱裂解法提取pMD18TGlbZIP质粒 5
1.2.3.7 灵芝bZIP家族基因沉默片段和沉默载体的双酶切 5
1.2.3.8 灵芝bZIP家族基因沉默片段和沉默载体酶切片段的琼脂糖纯化回收 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
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1.2.3.9 灵芝bZIP家族基因沉默片段和沉默载体酶切片段的连接 5
1.2.3.10 大肠杆菌感受态转化 5
1.2.3.11 碱裂解法提取pmiGlbZIP质粒 5
1.2.4 灵芝bZIP家族转录因子沉默转化子的转化及筛选 6
1.2.4.1 灵芝原生质体的制备及脂质体转化 6
1.2.4.2 灵芝bZIP转录因子沉默转化子沉默效率验证 6
1.2.5 灵芝bZIP家族转录因子沉默转化子灵芝三萜含量的测定 7
1.2.5.1 灵芝菌丝球的培养 7
1.2.5.2 分光光度计法测定三萜含量 8
1.2.6 热胁迫处理方法 8
1.2.7 氧化胁迫处理方法 8
1.2.8 统计方法 8
2 结果与分析 9
2.1 灵芝bZIP家族转录因子的系统性筛选 9
2.2 灵芝bZIP家族转录因子GlbZIP02和GlbZIP08的生物信息学分析 9
2.2.1 灵芝bZIP家族转录因子基因的基本生物学特性 9
2.2.2 灵芝GlbZIP02和GlbZIP08转录因子进化关系及结构域分析 10
2.3 灵芝GlbZIP02基因沉默菌株和GlbZIP08基因沉默菌株的构建 13
2.4 灵芝GlbZIP02和GlbZIP08转录因子对灵芝生长发育及次生代谢的影响 13
2.4.1 灵芝GlbZIP02、GlbZIP08基因沉默影响菌丝生长 13
2.4.2 灵芝GlbZIP02、GlbZIP08基因参与调控灵芝三萜合成 15
2.4.3 灵芝GlbZIP02、GlbZIP08基因参与非生物胁迫应答 16
2.4.3.1 灵芝GlbZIP02、GlbZIP08基因可能参与热胁迫对菌丝生长发育的调控 16
2.4.3.2灵芝GlbZIP02基因可能参与氧化胁迫对菌丝生长发育的调控 17
3 讨论 18
致谢 19
参考文献 19
附录 21
灵芝bZIP转录因子
对灵芝生长发育及次生代谢的影响
引言
灵芝（Ganoderma lucidum）是一种名贵的药用真菌，其主要药用成分为灵芝三萜等次生代谢产物。深入研究灵芝生长发育以及次生代谢的调控机制，能为灵芝的生产技术优化及药用价值开发奠定良好的理论基础，也能为从反式遗传学角度研究其他大型真菌提供参考。
灵芝主要次生代谢产物——灵芝三萜类化合物（又称灵芝酸Ganoderic acid），具有抗氧化、抗病毒、降血压和抗肿瘤等多种生理活性(Shiao 1992, Hajjaj, Mace et al. 2005)，是灵芝主要药用成分之一。灵芝三萜的合成途径已经清晰，其合成调控网络尚未被完全解析。碱性亮氨酸拉链（basic Leucine Zipper, bZIP）类转录因子是最古老广泛的真核生物转录因子家族，存在于所有真核生物中(Niu, RenshawGegg et al. 1999)。系统地研究这些转录因子的特性发现，不同bZIP家族成员在功能上既有互补，同时存在差异。在真菌中，bZIP蛋白质参与了调节菌丝生长、多种压力胁迫应答等生理活动。本实验室前期研究证明，茉莉酸甲酯是一种能显著诱导灵芝三萜生物合成的外源信号。在分析茉莉酸甲酯诱导下灵芝转录组的变化时，发现bZIP家族的转录因子AP1的表达显著上调(Ren, Li et al. 2013)；进一步研究发现灵芝中最典型的bZIP家族转录因子AP1参与了调控菌丝生长发育、细胞内氧化还原平衡、灵芝三萜的生物合成等生理过程。这启发了我们进一步探究灵芝其他bZIP蛋白的潜在功能。
本课题旨在通过系统地筛选灵芝bZIP家族转录因子，利用前期成功构建的灵芝bZIP转录因子沉默菌株GlbZIP02i和GlbZIP08i，初步观测灵芝bZIP家族转录因子GlbZIP02和GlbZIP08在灵芝生长发育、灵芝三萜合成、热胁迫及氧化胁迫应答过程中的潜在调控作用。
1 材料与方法
1.1 实验材料
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