利用ago2hitsclip提取mir210靶向rna的方法优化
微小RNA（miRNA）是具有内源性状的非编码RNA，其存在于真核生物中且具有调节功能。?目前各项研究都表明miRNA已经成为人类身体健康和疾病控制的关键效应物，其在基因表达调控中起到不可替代的作用。例如，研究发现缺氧可以影响多个miRNA的表达，其中miR-210的表达变化最为显着。在缺氧条件下， miR-210表达上调，会对细胞增殖起抑制作用，并且可以较长时间抑制线粒体的新陈代谢，减弱 DNA损伤修复的能力，促进血管再生，在胎儿发育、缺氧性疾病和肿瘤的病理过程中起着独特而重要作用。但目前miR-210的靶基因还不明确。所以我们可以使用交联免疫沉淀（HITS-CLIP）和高通量测序的方法破译Ago2与RNA相互作用位点。我们用甲醛处理交联 Argonaute2（ Ago2）蛋白- RNA复合物，然后利用免疫沉淀（IP），通过抗体与 Argonaute蛋白质的作用，拉下蛋白- RNA复合物，蛋白酶 K体系消化蛋白，Trizol法提取纯化 RNA，然后送往公司测序Ago2 HITS- CLIP为探索 miRNA在体内的作用的特异性和范围提供了一个通用的平台，并为确定临床相关的 miRNA- mRNA相互作用确定了精确的序列。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言4
1材料与方法5
1.1实验材料 5
1.1.1细胞株、质粒与miRNA5
1.1.2主要化学试剂5
1.1.3配置溶液、培养基及抗体5
1.2实验方法 5
1.2.1细胞培养与传代5
1.2.2细胞转染6
1.2.3甲醛交联（crosslink）6
1.2.4免疫沉淀（IP）6
1.2.5 Western blot6
1.2.6 分离与纯化7
1.2.7 RNA测序数据分析7
2 结果与分析7
2.1预实验结果分析7
2.2 SDSPAGE结果验证8
2.3 RNA浓度测定9
2.4 实验条件优化9
3 讨论 10
致谢 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
11
参考文献11
图1 Western blot结果图8
图2 SDSPAGE结果图8
图3 3个处理组RNA浓度测定结果图9
图4 实验技术路线9
利用Ago2 HITSCLIP提取miR210的靶向RNA的方法优化
引言
Argonaute（Ago）蛋白是一种由700至1200个氨基酸残基组成的约100kDa的碱性蛋白质，该结构在进化上高度保守，并在一些单细胞生物体和所有多细胞生物体中表达。Ago蛋白是RISC（RNAinduced silencing complex）的核心效应物, 能提供miRNA锚定位点，从而起到使靶基因的降解或翻译抑制的作用,它在基因沉默信号转导途径中发挥重要作用。人类可以表达Ago1，Ago2，Ago3和Ago4四个亚型，Ago1、Ago3和Ago4基因都定位在1号染色体上, Ago2基因则定位于8号染色体上,其中只有Ago2具有核酸内切酶活性，能够通过与miRNA结合并调节其活性，从而参与mRNA的基因沉默。真核生物的Ago蛋白包含三个结构域：PAZ、MID和MIDPIWI。其中，MID结构能使Ago2与mRNA的7甲基鸟嘌呤结合，从而抑制mRNA 的转录起始[1]。
微小RNA是由18至25个核苷酸组成的单链小RNA，广泛存在于线虫、果蝇、植物和所有真核生物中。microRNA是一种非编码RNA，没有开放阅读框(open reading frame)。其有三个特质：高度的保守性、组织特异性和时序性。microRNA基因位于遗传编码基因的内含子中，并且其一部分存在于基因间DNA序列中，形成成熟的microRNA后起到调控作用。microRNA的形成过程大致如下：基因组转录初级产物primicroRNA，然后由Dorsha在核内将其切成约60多个核苷酸组成的premicroRNA，并且结构中含有茎环结构。premicroRNA由转运子转移至细胞质后，在一些活化因子的作用下被RNaseⅢ和Dicer酶切割成双链RNA双体。由于结构中3端有不匹配突起存在，所以对应链的相对序列会不稳定，所以往往成熟miRNA都产自不稳定序列，只有一条链可以形成具有生物学功能的成熟miRNA。成熟miRNA因为其5’端的不稳定性被识别，并在Argonaute蛋白参与下形成RNA 诱导沉默复合物(RNAinduced silencing complex, RISC)之后，通过碱基对互补配对的原理，通过结合靶基因mRNA的3非翻译区（UTR）而形成的囊泡样结构在抑制mRNA翻译中起作用，或可以对mRNA产生基因沉默[2]。
许多研究表明，到目前为止，大多数microRNA在许多方面从低等植物到高等动物中都发挥了多重调节作用。越来越多的实验结果表明， microRNA具有几乎全部的潜力来调节生物学的各个方面，而不仅仅局限与在调控某个生理过程。研究发现缺氧可以影响多种miRNA的表达，其中miR210的表达变化最为显着。miR210是缺氧特异性的miRNA，在缺氧条件下表达稳定上调，且不受细胞种类和氧浓度的影响[3, 4]。 Fasanaro P 等研究显示，体外缺氧使得 miR210 在人脐静脉内皮细胞 (HUVE12) 中的表达上调，并进而促进 HUVE12 形成血管，首次证实了miR210在缺氧条件下促进血管生成的作用[5]。也有研究表明mir210在包括心脏以及脑血管的缺血性疾病中均有显著的作用，如miR210 在心脏肥大，心力衰竭，短暂局灶性脑缺血，下肢缺血以及脑缺血损伤等动物模型中均表达升高[6, 7]。随着近年来microRNA研究的深度和广度不断扩大，microRNA如何在肿瘤发生、发展和诱导凋亡中的作用逐渐成为研究热点。MiR210 在肾上腺皮质癌、口腔癌、非小细胞肺癌等癌症中均表达上调，miR210 在乳腺癌、胰腺癌和其他癌症中的高表达预示着其预后不良[8]。当然，以上列举的只是miR210的一部分作用功能研究情况，其他还有对细胞增殖的抑制作用，并且可以较长时间抑制线粒体的新陈代谢，减弱DNA损伤修复的能力，在胎儿发育等等方面起到重要作用。
然而，由于缺乏关于人体组织中miRNA靶向事件的全面的“组学”层面的观点，该领域的进展已经减慢。为了全面地明确一些重要的miRNA的调控靶基因，所以可以使用Ago HITSCLIP来定义在体内Ago与mRNA相互作用的位点，破译小鼠脑中miRNAmRNA相互作用的准确位点。这为探究各种生物环境中miRNA的直接靶基因提供了一个平台。
2003年，Darnell实验室在研究RNA结合蛋白Nova时发明了CLIP技术，2005年又改进了一部分实验流程[9, 10]。CLIP（交联免疫沉淀）是一种采用甲醛处理交联和免疫沉淀反应来鉴定RBPRNA相互作用的分子生物学技术。 CLIP的优势在于可以识别细胞内（交联发生的地方）与细胞溶解后可能发生的相互作用。后来，高通量测序技术的普及极大的提高了对核酸序列的分析能力，于是CLIP与高通量测序结合,发明了HITSCLIP(highthroughput sequencing of RNA isolated by crosslinking immunoprecipitation）[11]。高通量测序对于分析复杂 RNA结合谱特别适用，它可以在全基因组范围获取蛋白质的 RNA 结合位点以及结合 RNA 的丰度信息。所以该技术被广泛应用在(1) miRNA与其靶RNA的相互作用; (2)研究RBPs与靶RNAs的识别结合模式。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言4
1材料与方法5
1.1实验材料 5
1.1.1细胞株、质粒与miRNA5
1.1.2主要化学试剂5
1.1.3配置溶液、培养基及抗体5
1.2实验方法 5
1.2.1细胞培养与传代5
1.2.2细胞转染6
1.2.3甲醛交联（crosslink）6
1.2.4免疫沉淀（IP）6
1.2.5 Western blot6
1.2.6 分离与纯化7
1.2.7 RNA测序数据分析7
2 结果与分析7
2.1预实验结果分析7
2.2 SDSPAGE结果验证8
2.3 RNA浓度测定9
2.4 实验条件优化9
3 讨论 10
致谢 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
11
参考文献11
图1 Western blot结果图8
图2 SDSPAGE结果图8
图3 3个处理组RNA浓度测定结果图9
图4 实验技术路线9
利用Ago2 HITSCLIP提取miR210的靶向RNA的方法优化
引言
Argonaute（Ago）蛋白是一种由700至1200个氨基酸残基组成的约100kDa的碱性蛋白质，该结构在进化上高度保守，并在一些单细胞生物体和所有多细胞生物体中表达。Ago蛋白是RISC（RNAinduced silencing complex）的核心效应物, 能提供miRNA锚定位点，从而起到使靶基因的降解或翻译抑制的作用,它在基因沉默信号转导途径中发挥重要作用。人类可以表达Ago1，Ago2，Ago3和Ago4四个亚型，Ago1、Ago3和Ago4基因都定位在1号染色体上, Ago2基因则定位于8号染色体上,其中只有Ago2具有核酸内切酶活性，能够通过与miRNA结合并调节其活性，从而参与mRNA的基因沉默。真核生物的Ago蛋白包含三个结构域：PAZ、MID和MIDPIWI。其中，MID结构能使Ago2与mRNA的7甲基鸟嘌呤结合，从而抑制mRNA 的转录起始[1]。
微小RNA是由18至25个核苷酸组成的单链小RNA，广泛存在于线虫、果蝇、植物和所有真核生物中。microRNA是一种非编码RNA，没有开放阅读框(open reading frame)。其有三个特质：高度的保守性、组织特异性和时序性。microRNA基因位于遗传编码基因的内含子中，并且其一部分存在于基因间DNA序列中，形成成熟的microRNA后起到调控作用。microRNA的形成过程大致如下：基因组转录初级产物primicroRNA，然后由Dorsha在核内将其切成约60多个核苷酸组成的premicroRNA，并且结构中含有茎环结构。premicroRNA由转运子转移至细胞质后，在一些活化因子的作用下被RNaseⅢ和Dicer酶切割成双链RNA双体。由于结构中3端有不匹配突起存在，所以对应链的相对序列会不稳定，所以往往成熟miRNA都产自不稳定序列，只有一条链可以形成具有生物学功能的成熟miRNA。成熟miRNA因为其5’端的不稳定性被识别，并在Argonaute蛋白参与下形成RNA 诱导沉默复合物(RNAinduced silencing complex, RISC)之后，通过碱基对互补配对的原理，通过结合靶基因mRNA的3非翻译区（UTR）而形成的囊泡样结构在抑制mRNA翻译中起作用，或可以对mRNA产生基因沉默[2]。
许多研究表明，到目前为止，大多数microRNA在许多方面从低等植物到高等动物中都发挥了多重调节作用。越来越多的实验结果表明， microRNA具有几乎全部的潜力来调节生物学的各个方面，而不仅仅局限与在调控某个生理过程。研究发现缺氧可以影响多种miRNA的表达，其中miR210的表达变化最为显着。miR210是缺氧特异性的miRNA，在缺氧条件下表达稳定上调，且不受细胞种类和氧浓度的影响[3, 4]。 Fasanaro P 等研究显示，体外缺氧使得 miR210 在人脐静脉内皮细胞 (HUVE12) 中的表达上调，并进而促进 HUVE12 形成血管，首次证实了miR210在缺氧条件下促进血管生成的作用[5]。也有研究表明mir210在包括心脏以及脑血管的缺血性疾病中均有显著的作用，如miR210 在心脏肥大，心力衰竭，短暂局灶性脑缺血，下肢缺血以及脑缺血损伤等动物模型中均表达升高[6, 7]。随着近年来microRNA研究的深度和广度不断扩大，microRNA如何在肿瘤发生、发展和诱导凋亡中的作用逐渐成为研究热点。MiR210 在肾上腺皮质癌、口腔癌、非小细胞肺癌等癌症中均表达上调，miR210 在乳腺癌、胰腺癌和其他癌症中的高表达预示着其预后不良[8]。当然，以上列举的只是miR210的一部分作用功能研究情况，其他还有对细胞增殖的抑制作用，并且可以较长时间抑制线粒体的新陈代谢，减弱DNA损伤修复的能力，在胎儿发育等等方面起到重要作用。
然而，由于缺乏关于人体组织中miRNA靶向事件的全面的“组学”层面的观点，该领域的进展已经减慢。为了全面地明确一些重要的miRNA的调控靶基因，所以可以使用Ago HITSCLIP来定义在体内Ago与mRNA相互作用的位点，破译小鼠脑中miRNAmRNA相互作用的准确位点。这为探究各种生物环境中miRNA的直接靶基因提供了一个平台。
2003年，Darnell实验室在研究RNA结合蛋白Nova时发明了CLIP技术，2005年又改进了一部分实验流程[9, 10]。CLIP（交联免疫沉淀）是一种采用甲醛处理交联和免疫沉淀反应来鉴定RBPRNA相互作用的分子生物学技术。 CLIP的优势在于可以识别细胞内（交联发生的地方）与细胞溶解后可能发生的相互作用。后来，高通量测序技术的普及极大的提高了对核酸序列的分析能力，于是CLIP与高通量测序结合,发明了HITSCLIP(highthroughput sequencing of RNA isolated by crosslinking immunoprecipitation）[11]。高通量测序对于分析复杂 RNA结合谱特别适用，它可以在全基因组范围获取蛋白质的 RNA 结合位点以及结合 RNA 的丰度信息。所以该技术被广泛应用在(1) miRNA与其靶RNA的相互作用; (2)研究RBPs与靶RNAs的识别结合模式。
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/swgc/smkx/92.html
