一氧化氮对宰后猪肉钙激活酶，蛋白降解及蛋白氧化的影响
一氧化氮对宰后猪肉钙激活酶，蛋白降解及蛋白氧化的影响[20200614170936]
摘要：本试验的目的旨在研究一氧化氮及由一氧化氮所引起的蛋白质亚硝基化对宰后猪肉钙激活酶、蛋白降解及氧化的影响。试验采用五头六月龄的三元杂交猪，屠宰后45分钟内，取胴体右侧的猪背最长肌。将背最长肌切碎，随机分为三组。切碎后立即将三组肉样分别浸泡于水（对照组）；0.1 M一氧化氮合成酶抑制剂L-NAME溶液；1 mM一氧化氮促进剂DETA/NO溶液中。肉样与溶液的体积比为1:1。4 ℃条件下浸泡一天后取出，然后真空包装在4 ℃下存放1、4、7天。研究发现，4 ℃存放1天后，一氧化氮合成酶抑制剂组中，80 KDa的完整μ-钙激活酶含量明显减少，76 KDa降解产物明显增多(P<0.05)。同时，该组伴肌动球蛋白和伴肌球蛋白的降解比一氧化氮促进剂组要高(P<0.05)。当贮存1,4,7天后，一氧化氮促进剂组中蛋白质氧化程度明显高于一氧化氮合成酶抑制剂组(P<0.05)。这些数据都表明一氧化氮在调节宰后猪肉钙激活酶活性，蛋白降解及蛋白氧化发挥了重要作用。
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关键字:一氧化氮；钙激活酶；蛋白质水解；蛋白质氧化
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 材料与主要试剂 2
1.1.1 实验材料 2
1.1.2 主要试剂 2
1.2 试验设备 2
1.3 试验方法 2
1.3.1 原料样品的制备 2
1.3.2 肌浆蛋白的提取 2
1.3.3 肌原纤维蛋白的提取 3
1.3.4 变性聚丙酰胺凝胶电泳 3
1.3.5 蛋白免疫印迹 3
1.3.6 半定量分析 3
1.3.7 游离巯基的测定 3
1.3.8 统计方法 3
2 结果分析 4
2.1 μ-钙激活酶 4
2.2 伴肌动蛋白和伴肌球蛋白 5
2.3 游离巯基的含量 6
3 讨论 6
3.1 μ-钙激活酶 6
3.2 伴肌动蛋白和伴肌球蛋白 6
3.3 游离巯基含量 7
4 结论7
文中使用的缩略词 7
致谢 7
参考文献7
一氧化氮对宰后猪肉钙激活酶，蛋白降解及蛋白氧化的影响
生命基地101班 王梦琴
引言
蛋白质亚硝基化, 是指一氧化氮(NO)基团与蛋白质上的巯基发生共价结合的过程，在很多生理生化过程中具有重 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
要的调节作用。然而，一氧化氮及由一氧化氮所引起的蛋白质亚硝基化对鲜肉质量的影响鲜有报道。一些报道指出，鲜肉品质会受到宰前或宰后一氧化氮的影响[1-3]。鲜肉品质的改变可能是由于一氧化氮与钙激活酶发生了相互反应。然而，没有研究关注于一氧化氮及一氧化氮引起的蛋白质亚硝基化对宰后猪肉μ-钙激活酶、肌原纤维蛋白降解及氧化的影响。
宰后早期鲜肉中的各种生理生化反应，尤其是蛋白质降解可以影响猪肉的持水力和嫩度等品质。很多研究表明鲜肉的品质与μ-钙激活酶的活性密切相关。μ-钙激活酶在宰后肌肉蛋白质降解中发挥了最主要作用[4]。μ-钙激活酶包含一个80 KDa的催化亚基和一个28 KDa的调节亚基。其中催化亚基的结构域II 中115位点上含有一个半胱氨酸残基[5]，这导致μ-钙激活酶易发生蛋白质氧化及亚硝基化反应。当暴露在易氧化的环境条件下时，μ-钙激活酶催化区域108位点和115位点的半胱氨酸残基之间会形成二硫键，并抑制酶活性和酶自溶[6]。肌肉中的μ-钙激活酶在中性pH条件下活性基本不受亚硝基化影响。但是当pH下降至5.57时，80% 的μ-钙激活酶活性受到了抑制。而品质正常的猪肉宰后pH会从中性pH下降至5.3-5.7[8]。
骨骼肌中的一氧化氮产生于一氧化氮合成酶（NOS）催化精氨酸合成瓜氨酸的过程中。Brannan和Decker[9] 研究宰后成熟过程中一氧化氮合成酶活性的变化时发现，宰后24小时，猪肉中一氧化氮合成酶仍具有活性，并且当pH 在4.5-7.4之间时活性几乎不发生变化，这证明宰后pH的变化并不能影响一氧化氮产生。然而，没有研究通过调节一氧化氮合成酶活性来控制一氧化氮的产生，从而研究一氧化氮对鲜肉品质的影响。本试验的目的在于研究一氧化氮，以及由一氧化氮所引起的蛋白质亚硝基化对宰后猪肉μ-钙激活酶，蛋白降解及氧化的影响。
1 材料和方法
1.1 材料与主要试剂
1.1.1 试验材料
五头六月龄、活体重约为100±10 Kg的三元杂交猪，在苏食淮安屠宰厂进行屠宰。
1.1.2 主要试剂
一氧化氮合成酶抑制剂 L-NAME（甲酯盐酸盐）美国Sigma公司
一氧化氮促进剂 DETA/NO（二亚乙基三胺） 美国 Sigma公司
蛋白质分子量标准 Maker10-250KDa 美国Thermo公司
μ-钙激活酶抗体 美国Thermo公司
过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗 Abcam公司
1.2 试验设备
高速匀浆机（Ultra Turrax T25 BASIS） 德国IKA公司
落地式高速冷冻离心机 （Avanti J-E） 美国Beckman Coulter公司
酶标仪 MD公司
小型电泳垂直系统 美国Bio-Rad公司
Image-LA4000凝胶成像系统 美国GE公司
智能恒温数显水箱（ZKSY-600） *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
江苏南京科尔仪器设备有限公司
电子分析天平 日本SHIMADZU公司
UV-2450 型紫外-可见分光光度计 日本岛津公司
1.3 试验方法
1.3.1 原料样品的准备
宰后45分钟，取猪胴体右侧的背最长肌。将背最长肌切碎，随机分为三组。切碎后立即将三组肉样分别浸泡于水（对照组）；0.1 M一氧化氮合成酶抑制剂L-NAME溶液；1 mM一氧化氮促进剂DETA/NO溶液中。肉样与溶液的体积比为1:1。4 ℃条件下浸泡一天后取出，真空包装。样品在4 ℃条件下存放1、4、7天后取样，然后存于-80 ℃冰箱中备用。
1.3.2 肌浆蛋白的提取
肌浆蛋白的提取参照Veiseth等的方法并稍作修改[10]。取0.5 g剪碎后的肉样，加入3 mL预冷后的提取液（100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA，0.05% β-巯基乙醇，pH 8.3），用Polytron匀浆机低温条件下匀两次，每次15000 rpm，15 s，间隔15 s。4 ℃条件下16,000g离心30 min。离心后取上清液，采用BCA试剂盒测定浓度。然后用去离子水将蛋白浓度调至6.4 mg/ml。每体积的蛋白与0.5体积的样品处理液（3 mM EDTA, 3%[wt/vol] SDS, 20% [vol/vol] glycerol, 0.003% [wt/vol] pyronin Y, 30 mM Tris-HCl, pH 8.0）和0.1体积的β-巯基乙醇混合，将蛋白浓度调至4 mg/ml。混匀后在95℃水浴锅中加热5分钟，分装后存于-80℃冰箱备用。
2 结果与分析
2.1 μ-钙激活酶
在猪肉宰后成熟过程中，μ-钙激活酶参与一些肌原纤维蛋白和骨架蛋白的降解[15]。宰后的肌肉中，钙激活酶的活性与其自溶有密切关系。被激活的钙激活酶会从80 KDa经78 KDa的中间降解产物最终降解为76 KDa。在宰后早期的肌肉中，钙激活酶的自溶程度可以反应其活性变化[16]。为了探究一氧化氮对钙激活酶的影响，本试验采用蛋白质免疫印迹法检测宰后24小时钙激活酶的降解情况。
摘要：本试验的目的旨在研究一氧化氮及由一氧化氮所引起的蛋白质亚硝基化对宰后猪肉钙激活酶、蛋白降解及氧化的影响。试验采用五头六月龄的三元杂交猪，屠宰后45分钟内，取胴体右侧的猪背最长肌。将背最长肌切碎，随机分为三组。切碎后立即将三组肉样分别浸泡于水（对照组）；0.1 M一氧化氮合成酶抑制剂L-NAME溶液；1 mM一氧化氮促进剂DETA/NO溶液中。肉样与溶液的体积比为1:1。4 ℃条件下浸泡一天后取出，然后真空包装在4 ℃下存放1、4、7天。研究发现，4 ℃存放1天后，一氧化氮合成酶抑制剂组中，80 KDa的完整μ-钙激活酶含量明显减少，76 KDa降解产物明显增多(P<0.05)。同时，该组伴肌动球蛋白和伴肌球蛋白的降解比一氧化氮促进剂组要高(P<0.05)。当贮存1,4,7天后，一氧化氮促进剂组中蛋白质氧化程度明显高于一氧化氮合成酶抑制剂组(P<0.05)。这些数据都表明一氧化氮在调节宰后猪肉钙激活酶活性，蛋白降解及蛋白氧化发挥了重要作用。
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关键字:一氧化氮；钙激活酶；蛋白质水解；蛋白质氧化
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 材料与主要试剂 2
1.1.1 实验材料 2
1.1.2 主要试剂 2
1.2 试验设备 2
1.3 试验方法 2
1.3.1 原料样品的制备 2
1.3.2 肌浆蛋白的提取 2
1.3.3 肌原纤维蛋白的提取 3
1.3.4 变性聚丙酰胺凝胶电泳 3
1.3.5 蛋白免疫印迹 3
1.3.6 半定量分析 3
1.3.7 游离巯基的测定 3
1.3.8 统计方法 3
2 结果分析 4
2.1 μ-钙激活酶 4
2.2 伴肌动蛋白和伴肌球蛋白 5
2.3 游离巯基的含量 6
3 讨论 6
3.1 μ-钙激活酶 6
3.2 伴肌动蛋白和伴肌球蛋白 6
3.3 游离巯基含量 7
4 结论7
文中使用的缩略词 7
致谢 7
参考文献7
一氧化氮对宰后猪肉钙激活酶，蛋白降解及蛋白氧化的影响
生命基地101班 王梦琴
引言
蛋白质亚硝基化, 是指一氧化氮(NO)基团与蛋白质上的巯基发生共价结合的过程，在很多生理生化过程中具有重 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
要的调节作用。然而，一氧化氮及由一氧化氮所引起的蛋白质亚硝基化对鲜肉质量的影响鲜有报道。一些报道指出，鲜肉品质会受到宰前或宰后一氧化氮的影响[1-3]。鲜肉品质的改变可能是由于一氧化氮与钙激活酶发生了相互反应。然而，没有研究关注于一氧化氮及一氧化氮引起的蛋白质亚硝基化对宰后猪肉μ-钙激活酶、肌原纤维蛋白降解及氧化的影响。
宰后早期鲜肉中的各种生理生化反应，尤其是蛋白质降解可以影响猪肉的持水力和嫩度等品质。很多研究表明鲜肉的品质与μ-钙激活酶的活性密切相关。μ-钙激活酶在宰后肌肉蛋白质降解中发挥了最主要作用[4]。μ-钙激活酶包含一个80 KDa的催化亚基和一个28 KDa的调节亚基。其中催化亚基的结构域II 中115位点上含有一个半胱氨酸残基[5]，这导致μ-钙激活酶易发生蛋白质氧化及亚硝基化反应。当暴露在易氧化的环境条件下时，μ-钙激活酶催化区域108位点和115位点的半胱氨酸残基之间会形成二硫键，并抑制酶活性和酶自溶[6]。肌肉中的μ-钙激活酶在中性pH条件下活性基本不受亚硝基化影响。但是当pH下降至5.57时，80% 的μ-钙激活酶活性受到了抑制。而品质正常的猪肉宰后pH会从中性pH下降至5.3-5.7[8]。
骨骼肌中的一氧化氮产生于一氧化氮合成酶（NOS）催化精氨酸合成瓜氨酸的过程中。Brannan和Decker[9] 研究宰后成熟过程中一氧化氮合成酶活性的变化时发现，宰后24小时，猪肉中一氧化氮合成酶仍具有活性，并且当pH 在4.5-7.4之间时活性几乎不发生变化，这证明宰后pH的变化并不能影响一氧化氮产生。然而，没有研究通过调节一氧化氮合成酶活性来控制一氧化氮的产生，从而研究一氧化氮对鲜肉品质的影响。本试验的目的在于研究一氧化氮，以及由一氧化氮所引起的蛋白质亚硝基化对宰后猪肉μ-钙激活酶，蛋白降解及氧化的影响。
1 材料和方法
1.1 材料与主要试剂
1.1.1 试验材料
五头六月龄、活体重约为100±10 Kg的三元杂交猪，在苏食淮安屠宰厂进行屠宰。
1.1.2 主要试剂
一氧化氮合成酶抑制剂 L-NAME（甲酯盐酸盐）美国Sigma公司
一氧化氮促进剂 DETA/NO（二亚乙基三胺） 美国 Sigma公司
蛋白质分子量标准 Maker10-250KDa 美国Thermo公司
μ-钙激活酶抗体 美国Thermo公司
过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗 Abcam公司
1.2 试验设备
高速匀浆机（Ultra Turrax T25 BASIS） 德国IKA公司
落地式高速冷冻离心机 （Avanti J-E） 美国Beckman Coulter公司
酶标仪 MD公司
小型电泳垂直系统 美国Bio-Rad公司
Image-LA4000凝胶成像系统 美国GE公司
智能恒温数显水箱（ZKSY-600） *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
江苏南京科尔仪器设备有限公司
电子分析天平 日本SHIMADZU公司
UV-2450 型紫外-可见分光光度计 日本岛津公司
1.3 试验方法
1.3.1 原料样品的准备
宰后45分钟，取猪胴体右侧的背最长肌。将背最长肌切碎，随机分为三组。切碎后立即将三组肉样分别浸泡于水（对照组）；0.1 M一氧化氮合成酶抑制剂L-NAME溶液；1 mM一氧化氮促进剂DETA/NO溶液中。肉样与溶液的体积比为1:1。4 ℃条件下浸泡一天后取出，真空包装。样品在4 ℃条件下存放1、4、7天后取样，然后存于-80 ℃冰箱中备用。
1.3.2 肌浆蛋白的提取
肌浆蛋白的提取参照Veiseth等的方法并稍作修改[10]。取0.5 g剪碎后的肉样，加入3 mL预冷后的提取液（100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA，0.05% β-巯基乙醇，pH 8.3），用Polytron匀浆机低温条件下匀两次，每次15000 rpm，15 s，间隔15 s。4 ℃条件下16,000g离心30 min。离心后取上清液，采用BCA试剂盒测定浓度。然后用去离子水将蛋白浓度调至6.4 mg/ml。每体积的蛋白与0.5体积的样品处理液（3 mM EDTA, 3%[wt/vol] SDS, 20% [vol/vol] glycerol, 0.003% [wt/vol] pyronin Y, 30 mM Tris-HCl, pH 8.0）和0.1体积的β-巯基乙醇混合，将蛋白浓度调至4 mg/ml。混匀后在95℃水浴锅中加热5分钟，分装后存于-80℃冰箱备用。
2 结果与分析
2.1 μ-钙激活酶
在猪肉宰后成熟过程中，μ-钙激活酶参与一些肌原纤维蛋白和骨架蛋白的降解[15]。宰后的肌肉中，钙激活酶的活性与其自溶有密切关系。被激活的钙激活酶会从80 KDa经78 KDa的中间降解产物最终降解为76 KDa。在宰后早期的肌肉中，钙激活酶的自溶程度可以反应其活性变化[16]。为了探究一氧化氮对钙激活酶的影响，本试验采用蛋白质免疫印迹法检测宰后24小时钙激活酶的降解情况。
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