外生菌根真菌（emf）耐铬的生理与分子机制研究
选用具有Cr耐性差异的两株Pisolithus属外生菌根真菌（Ectomycorrhizal fungi , EMF），研究了Cr处理对EMF菌株生长、菌液pH、真菌分泌的有机酸种类及分泌量、有机酸分泌关键酶活性等生理指标的影响。此外，实验对Cr处理前后的Cr耐性与敏感菌株进行了转录组分析，通过转录组分析和基因差异表达情况来研究调控耐Cr性状、参与Cr(VI)还原的分子机制。结果表明，EMF对Cr具有外质体屏障作用及一定的吸附能力，同时菌体可将Cr(VI)还原为Cr(III)，且在高浓度Cr胁迫下菌体可通过分泌草酸与Cr离子螯合的方式缓解毒害。而在后续的转录组分析中，我们还发现敏感菌株中316个基因特异性上调，综合前期实验现象推断这部分上调基因是关于高价铬还原的部分基因；同时根据对比两菌株基因变化差异，发现了耐受菌株中提高异柠檬酸裂解酶活性有关的48个基因。本研究结果为探究外生菌根真菌（EMF）耐Cr生理与分子机制提供了理论依据。
目录
摘要1
关键词1
Abstract 1
Key words1
1 材料与方法2
实验材料2
1.1.1外生菌根真菌菌株2
1.1.2培养基2
1.2耐铬菌株的筛选及耐铬能力的测定2
1.2.1耐铬菌株的筛选2
1.2.2 Cr胁迫对耐性与敏感菌株生长的影响2
1.3 EMF对Cr的吸收与Cr(VI)还原能力的探究2
1.3.1菌液与样品液的配制2
1.3.2总Cr的测定3
1.3.3 Cr(VI)含量的测定3
1.4 Cr处理后菌液pH的变化3
1.5 Cr对EMF分泌低分子量有机酸的影响3
1.6 Cr处理前后有机酸分泌关键酶活性的检测分析3
1.6.1苹果酸脱氢酶3
1.6.2异柠檬酸裂解酶3
1.7转录组测序4
2 结果与分析.4
2.1 Cr耐性菌株和敏感菌株的筛选4
2.2原生质膜对Cr的屏障与吸收作用5
2.3 EMF对Cr(VI)的还原作用6
2.4 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
Cr对外生菌根真菌分泌有机酸的影响7
2.5 Cr处理前后调控有机酸（草酸）分泌的关键酶活性的变化7
2.5.1苹果酸脱氢酶7
2.5.2异柠檬酸裂解酶7
2.6转录组测序及相关功能基因的确定8
3讨论.......10
致谢 11
参考文献 11 外生菌根真菌（EMF）耐铬的生理与分子机制研究
命基131 周宁
引言
土壤重金属铬污染日趋严重，铬已经成为土壤和水体重要的污染元素之一，同时Cr(VI)有明显的致癌和致畸作用。土壤重金属污染修复的必要性日益凸显，本实验旨在通过对Cr对外生菌根真菌（EMF）的影响等相关研究，完善植物修复重金属污染物中的菌根修复内容。本实验借鉴课题组已有研究，选用两株同属不同种但Cr耐性差异较大的外生菌根真菌，在外源添加Cr的情况下，研究外生菌根真菌菌株生长状况、菌液pH变化、外生菌根真菌生长过程中分泌有机酸的种类与含量，以及有机酸分泌关键酶的活性和数量等[1]。为进一步丰富和补充外生菌根真菌的耐Cr机制提供科学依据。
迄今为止，尽管关于Cr毒机理的研究已有大量报道，但国内外学者的研究成果主要集中在植物体内的Cr分布规律，对植物根系耐Cr机理的研究相对较少[2]。另外，国内外对细菌的耐铬机制做了大量的研究，少量真菌也具有Cr的耐性与还原能力，但还没有对外生菌根真菌中耐Cr菌进行过筛选及耐性机制的研究。
对于重金属污染土壤的植物修复技术来说，不论是污染农田的植物还是矿区土壤的植物，EMF都显示出了良好的应用前景[3]。在重金属污染条件下， EMF真菌可以改善植物生长状况，减轻重金属对植物的毒害，影响植物对重金属的吸收和转运，加快土壤中重金属元素的植物提取或植物稳定，因而在重金属污染土壤的植物修复中受到越来越多的关注[4]。同时，EMF真菌资源丰富，生物学特性各异，生态适应性强，这为筛选优良真菌菌种（株）提供了可能。综上所述，外生菌根真菌对植物修复的理论和应用基础研究仍需加强，本实验的研究目的就展现了良好的应用前景。
1 材料与方法
实验材料
EMF菌株
编号
Number
菌株
Strain
菌株来源
Source
Pt
Pisolithus.sp1
本实验室
Tq
Pisolithus.sp2
本实验室
Cg
Cenococcum geophilum
本实验室
LA
Laccaria amethystina
本实验室
SQLA
Laccaria.sp
本实验室
LB
Hebeloma vinosophyllum
本实验室
1.1.2 培养基
Kottke培养基组成(每升含量):无水CaCl2 0.05g、NaCl 0.025g、KH2PO4 0.5g、（NH4）2HPO4 0.5g、MgSO47H2O 0.15g、FeCl36H2O 1mg、VB1 0.1mg、无水葡萄糖 10g、KCl 0.3728g、 H3BO3 0.1546g、MnSO4H2O 0.0845g、ZnSO47H2O 0.0575g、CuSO45H2O 0.0125g、（NH4）6Mo7O24 0.0018g
1.2耐铬菌株的筛选及耐铬能力的测定
1.2.1耐铬菌株的筛选
本实验Cr浓度梯度设计为：0mg/L，5 mg/L，10mg/L，20 mg/L，30mg/L。25℃培养箱中暗培养、活化20天的六种外生菌根真菌（La、Lb、SQLa、Cg、Pt、Tq）备用。分别制备上述5个Cr处理浓度的固体培养基。在培养皿上接种活化好的菌块边缘处直径6.5 mm的新鲜菌块于培养箱中相同条件下暗培养。每3天测定一次菌斑直径，根据生长状况差异及半致死浓度EC50，筛选出Pisolithus属Cr耐性差异最大的两株菌，每个处理设6个重复。
1.2.2 Cr胁迫对耐性与敏感菌株生长的影响
1.2.2.1固体培养
本实验Cr浓度梯度设计为：0mg/L，2 mg/L，5 mg/L，10 mg/L，20 mg/L，50 mg/L。1.2.1中筛选出的两种菌（耐性菌株和敏感菌株）经25℃培养箱中暗培养、活化20天后备用。分别制备上述6个Cr处理浓度的固体培养基。在培养皿上接种活化好的菌块边缘处直径6.5 mm的新鲜菌块于培养箱中相同条件下暗培养。并在培养的第4天、第8天、第12天进行菌斑直径的测定，每个处理设4个重复。
目录
摘要1
关键词1
Abstract 1
Key words1
1 材料与方法2
实验材料2
1.1.1外生菌根真菌菌株2
1.1.2培养基2
1.2耐铬菌株的筛选及耐铬能力的测定2
1.2.1耐铬菌株的筛选2
1.2.2 Cr胁迫对耐性与敏感菌株生长的影响2
1.3 EMF对Cr的吸收与Cr(VI)还原能力的探究2
1.3.1菌液与样品液的配制2
1.3.2总Cr的测定3
1.3.3 Cr(VI)含量的测定3
1.4 Cr处理后菌液pH的变化3
1.5 Cr对EMF分泌低分子量有机酸的影响3
1.6 Cr处理前后有机酸分泌关键酶活性的检测分析3
1.6.1苹果酸脱氢酶3
1.6.2异柠檬酸裂解酶3
1.7转录组测序4
2 结果与分析.4
2.1 Cr耐性菌株和敏感菌株的筛选4
2.2原生质膜对Cr的屏障与吸收作用5
2.3 EMF对Cr(VI)的还原作用6
2.4 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
Cr对外生菌根真菌分泌有机酸的影响7
2.5 Cr处理前后调控有机酸（草酸）分泌的关键酶活性的变化7
2.5.1苹果酸脱氢酶7
2.5.2异柠檬酸裂解酶7
2.6转录组测序及相关功能基因的确定8
3讨论.......10
致谢 11
参考文献 11 外生菌根真菌（EMF）耐铬的生理与分子机制研究
命基131 周宁
引言
土壤重金属铬污染日趋严重，铬已经成为土壤和水体重要的污染元素之一，同时Cr(VI)有明显的致癌和致畸作用。土壤重金属污染修复的必要性日益凸显，本实验旨在通过对Cr对外生菌根真菌（EMF）的影响等相关研究，完善植物修复重金属污染物中的菌根修复内容。本实验借鉴课题组已有研究，选用两株同属不同种但Cr耐性差异较大的外生菌根真菌，在外源添加Cr的情况下，研究外生菌根真菌菌株生长状况、菌液pH变化、外生菌根真菌生长过程中分泌有机酸的种类与含量，以及有机酸分泌关键酶的活性和数量等[1]。为进一步丰富和补充外生菌根真菌的耐Cr机制提供科学依据。
迄今为止，尽管关于Cr毒机理的研究已有大量报道，但国内外学者的研究成果主要集中在植物体内的Cr分布规律，对植物根系耐Cr机理的研究相对较少[2]。另外，国内外对细菌的耐铬机制做了大量的研究，少量真菌也具有Cr的耐性与还原能力，但还没有对外生菌根真菌中耐Cr菌进行过筛选及耐性机制的研究。
对于重金属污染土壤的植物修复技术来说，不论是污染农田的植物还是矿区土壤的植物，EMF都显示出了良好的应用前景[3]。在重金属污染条件下， EMF真菌可以改善植物生长状况，减轻重金属对植物的毒害，影响植物对重金属的吸收和转运，加快土壤中重金属元素的植物提取或植物稳定，因而在重金属污染土壤的植物修复中受到越来越多的关注[4]。同时，EMF真菌资源丰富，生物学特性各异，生态适应性强，这为筛选优良真菌菌种（株）提供了可能。综上所述，外生菌根真菌对植物修复的理论和应用基础研究仍需加强，本实验的研究目的就展现了良好的应用前景。
1 材料与方法
实验材料
EMF菌株
编号
Number
菌株
Strain
菌株来源
Source
Pt
Pisolithus.sp1
本实验室
Tq
Pisolithus.sp2
本实验室
Cg
Cenococcum geophilum
本实验室
LA
Laccaria amethystina
本实验室
SQLA
Laccaria.sp
本实验室
LB
Hebeloma vinosophyllum
本实验室
1.1.2 培养基
Kottke培养基组成(每升含量):无水CaCl2 0.05g、NaCl 0.025g、KH2PO4 0.5g、（NH4）2HPO4 0.5g、MgSO47H2O 0.15g、FeCl36H2O 1mg、VB1 0.1mg、无水葡萄糖 10g、KCl 0.3728g、 H3BO3 0.1546g、MnSO4H2O 0.0845g、ZnSO47H2O 0.0575g、CuSO45H2O 0.0125g、（NH4）6Mo7O24 0.0018g
1.2耐铬菌株的筛选及耐铬能力的测定
1.2.1耐铬菌株的筛选
本实验Cr浓度梯度设计为：0mg/L，5 mg/L，10mg/L，20 mg/L，30mg/L。25℃培养箱中暗培养、活化20天的六种外生菌根真菌（La、Lb、SQLa、Cg、Pt、Tq）备用。分别制备上述5个Cr处理浓度的固体培养基。在培养皿上接种活化好的菌块边缘处直径6.5 mm的新鲜菌块于培养箱中相同条件下暗培养。每3天测定一次菌斑直径，根据生长状况差异及半致死浓度EC50，筛选出Pisolithus属Cr耐性差异最大的两株菌，每个处理设6个重复。
1.2.2 Cr胁迫对耐性与敏感菌株生长的影响
1.2.2.1固体培养
本实验Cr浓度梯度设计为：0mg/L，2 mg/L，5 mg/L，10 mg/L，20 mg/L，50 mg/L。1.2.1中筛选出的两种菌（耐性菌株和敏感菌株）经25℃培养箱中暗培养、活化20天后备用。分别制备上述6个Cr处理浓度的固体培养基。在培养皿上接种活化好的菌块边缘处直径6.5 mm的新鲜菌块于培养箱中相同条件下暗培养。并在培养的第4天、第8天、第12天进行菌斑直径的测定，每个处理设4个重复。
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