EDDS及柠檬酸对铜污染土壤中金属元素的解析规律研究
EDDS及柠檬酸对铜污染土壤中金属元素的解析规律研究[20200614171034]
摘要：多胺是一类含有两个或多个氨基的化合物，可与带负电的磷脂、蛋白质和核酸结合，参与植物细胞的分裂、分化、物质运输和植物抗逆反应等重要的生理生化过程。根据降解的底物氨基数不同，氨氧化酶包括二胺氧化酶（Copper amine oxidase,CuAO,EC1.4.3.6）和多胺氧化酶（Polyamine oxidase，PAO，EC1.5.3.11）。其中二胺氧化酶能高效降解腐胺（putrescine， Put）、尸胺（cadaverine，Cad）。
植物生长素IBA是一种能够显著抑制主根伸长并促进侧根发生的植物激素。我们利用拟南芥进行IBA对WT和cuaoζ突变体的处理实验，二胺氧化酶抑制剂或DMTU处理实验及CuAOζ基因的回补实验等结果表明， 二胺氧化酶正向调控IBA诱导的拟南芥侧根发育。
NPA（生长素极性运输抑制剂）和BFA（囊泡运输抑制剂）对IBA诱导CuAOζ蛋白的升高和向质膜募集无影响，暗示生长素的囊泡运输和极性分布位于CuAOζ蛋白基因的下游。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
关键字:侧根；IBA；二胺氧化酶；过氧化氢
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 4
引言 4
1 材料与方法 4
1. 1 实验材料 4
1. 2 实验方法 5
1. 2. 1 拟南芥种子的消毒 5
1. 2. 2 拟南芥植株的培养条件 5
1. 2. 3 过氧化氢染色 5
2 结果与分析 5
2．1 二胺氧化酶来源的H2O2正调控侧根发育 5
2．2 二胺氧化酶CuAOζ调控IBA诱导的侧根发育 7
2.3 生长素极性运输抑制剂NPA和囊泡运输抑制剂BFA对根发育的影响 10
3 讨论 12
致谢 12
参考文献 13
拟南芥二胺氧化酶调控侧根发育的机理研究
引言
多胺是一类低分子量的脂肪族含氮碱,广泛存在于植物体内，并具有多种生理作用，如促进生长，提高种子活力和发芽力；刺激不定根产生，促进根系对无机离子的吸收；抑制蛋白酶与RNA酶活性的提高，延缓叶片衰老，延缓叶绿素的分解；调节与光敏素有关的生长和形态建成，调节开花过程；提高抗逆性和抗渗透胁迫。多胺氧化酶能够调控植物体内的多胺含量，以维持植物体内胺类化合物的代谢平衡。二胺氧化酶主要作用于腐胺和尸胺等二胺，将其降解并产生信号分子H2O2，调控植物侧根发育。
拟南芥有10个编码二胺氧化酶的基因，根据蛋白序列保守性和相似性，分别命名为CuAOα（3）、β（1）、γ（2）、δ（2）、ε（1）和ζ（1）。CuAOζ蛋白 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
主要分布在主根的皮层、内皮层、根冠和中轴细胞，而在表皮层表达较弱；在侧根主要分布在表皮层和皮层细胞。CuAOζ应答内源生长素产生H2O2，诱导皮层生长素输出蛋白的极性改变，提高向侧根运输的生长素水平，促进侧根的生长发育。
NPA和BFA分别能影响生长素的极性运输和囊泡运输，利用两种试剂处理IBA诱导的拟南芥植株，以了解和推测CuAOζ基因的位置。
1 材料与方法
1. 1 实验材料
以Columbia生态型拟南芥野生型（wild type, WT）、T-DNA插入CuAO缺失突变体（SALK_095214）为实验材料。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 拟南芥种子的消毒
先用75%的乙醇浸泡种子5 min，然后用无菌水冲洗2次，再用2%的次氯酸钠消毒10 min，用无菌水冲洗4-5次。消毒后的种子播种于无菌MS培养上。
MS培养基配方（100 ml）：0.44 g MS盐（Sigma），2%蔗糖，1.0%琼脂粉。121 ℃高温灭菌20 min，铺板于9 cm的无菌玻璃培养皿。
1. 2. 2 拟南芥植株的培养条件
4 °C环境春化3 d，置于光照强度为160 μmol photons m-2s-1、10/14 h（23 °C/18 °C）（白天/夜晚）的光周期、60%相对湿度的生长室内生长。一周后将幼苗移至土：蛭石（2：1）的混合而成的生长介质中。
1. 2. 3 过氧化氢染色
过氧化氢专一性的染料BES-H2O2-Ac购于日本Wako公司。母液溶解到DMSO配成20 mM母液，工作浓度为10 μM。不同处理的拟南芥幼苗在BES-H2O2-Ac溶液（用1 mM MES-Tris，pH 6.5稀释）染色10-30 min，然后用缓冲液洗3-5次，每次10 min。用Zeiss 780激光共聚焦显微镜观察绿色荧光，激发波长488 nm，吸收波长535 nm。
2 结果与分析
2．1 二胺氧化酶来源的H2O2正调控侧根发育
IBA能有效抑制拟南芥主根生长并促进侧根发生。我们将恒温培养6天的野生型（WT）拟南芥幼苗，放置于含有10 μM IBA的1/2 MS培养基的培养皿中处理，6天后，统计侧根密度及总长，以及主根长度。结果表明，IBA处理后，幼苗侧根密度和总长显著增加（图2.1.1A和B）。我们在IBA处理的同时分别加入二胺氧化酶的专一性抑制剂AG（aminoguanidine，氨基胍）或BEA（2-bromoethylamine，2-溴乙胺）。结果表明，在不加入IBA处理时，与对照相比，AG和BEA处理对根发育无显著作用；AG和BEA均明显抑制IBA诱导的侧根发育（图2.1.1A-C）。另外， H2O2的清除剂DMTU（Dimethylthiourea，二甲基硫脲）的抑制效果更明显，其主根长、侧根密度和侧根总长显著减少（图2.1.1A-C）。上述结果初步表明，二胺氧化酶来源的H2O2正调控IBA诱导的侧根发育。
图2.1.1 CuAO来源的H2O2调控IBA诱导的侧根发育
Fig. 2.1.1 Regulation of IBA-regulated root development by CuA *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
O-derived H2O2
生长6 d的拟南芥幼苗转移到不同培养基进行处理，处理7 d后统计侧根根长和侧根密度并拍照。The 6-day-old seedlings were transferred to different treatment medium for 7 d before measuring number and total length of lateral roots. Asterisks indicate that the mean value is significantly different from that of the control (*P < 0.05, **P < 0.01).
我们利用H2O2专一性的荧光染料BES-H2O2-Ac标记根部H2O2。结果表明，拟南芥根部皮层部分荧光值较高，其中伸长区的荧光较强；用10 μM IBA处理1 d后，根部H2O2含量显著上升。而加入二胺氧化酶抑制剂AG、BEA或H2O2清除剂DMTU后明显抑制了IBA诱导的H2O2浓度的升高（图2.1.2A-B）。
图2.1.2 野生型拟南芥根部H2O2分布和含量测定
Fig. 2.1.2 H2O2 distribution in developmental roots in wide-type Arabidopsis.
MS上生长7 d的幼苗，在IBA处理培养基（或加入AG，BEA和DMTU）处理24 h后，利用荧光染料BES-H2O2-Ac进行根部染色15 min，然后利用激光共聚焦拍照并统计根部荧光强度。生长10-14天的野生型幼苗进行侧根H2O2的测定。IBA，10 μM；AG，250 μM；BEA，250 μM；DMTU，500 μM。The 6-day-old seedlings were treated with IBA with or without AG, BEA and DMTU for 24 h before root staining by BES-H2O2-Ac. The lateral roots from 10 to 14-day-old seedlings were used for florescence assay of lateral roots by confocal microscope. IBA, 10 μM; AG, 250 μM; BEA, 250 μM; DMTU, 500 μM. The asterisks indicate that the mean value is significantly different from that of the control wihout IBA treatment (*P < 0.05)
摘要：多胺是一类含有两个或多个氨基的化合物，可与带负电的磷脂、蛋白质和核酸结合，参与植物细胞的分裂、分化、物质运输和植物抗逆反应等重要的生理生化过程。根据降解的底物氨基数不同，氨氧化酶包括二胺氧化酶（Copper amine oxidase,CuAO,EC1.4.3.6）和多胺氧化酶（Polyamine oxidase，PAO，EC1.5.3.11）。其中二胺氧化酶能高效降解腐胺（putrescine， Put）、尸胺（cadaverine，Cad）。
植物生长素IBA是一种能够显著抑制主根伸长并促进侧根发生的植物激素。我们利用拟南芥进行IBA对WT和cuaoζ突变体的处理实验，二胺氧化酶抑制剂或DMTU处理实验及CuAOζ基因的回补实验等结果表明， 二胺氧化酶正向调控IBA诱导的拟南芥侧根发育。
NPA（生长素极性运输抑制剂）和BFA（囊泡运输抑制剂）对IBA诱导CuAOζ蛋白的升高和向质膜募集无影响，暗示生长素的囊泡运输和极性分布位于CuAOζ蛋白基因的下游。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
关键字:侧根；IBA；二胺氧化酶；过氧化氢
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 4
引言 4
1 材料与方法 4
1. 1 实验材料 4
1. 2 实验方法 5
1. 2. 1 拟南芥种子的消毒 5
1. 2. 2 拟南芥植株的培养条件 5
1. 2. 3 过氧化氢染色 5
2 结果与分析 5
2．1 二胺氧化酶来源的H2O2正调控侧根发育 5
2．2 二胺氧化酶CuAOζ调控IBA诱导的侧根发育 7
2.3 生长素极性运输抑制剂NPA和囊泡运输抑制剂BFA对根发育的影响 10
3 讨论 12
致谢 12
参考文献 13
拟南芥二胺氧化酶调控侧根发育的机理研究
引言
多胺是一类低分子量的脂肪族含氮碱,广泛存在于植物体内，并具有多种生理作用，如促进生长，提高种子活力和发芽力；刺激不定根产生，促进根系对无机离子的吸收；抑制蛋白酶
拟南芥有10个编码二胺氧化酶的基因，根据蛋白序列保守性和相似性，分别命名为CuAOα（3）、β（1）、γ（2）、δ（2）、ε（1）和ζ（1）。CuAOζ蛋白 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
主要分布在主根的皮层、内皮层、根冠和中轴细胞，而在表皮层表达较弱；在侧根主要分布在表皮层和皮层细胞。CuAOζ应答内源生长素产生H2O2，诱导皮层生长素输出蛋白的极性改变，提高向侧根运输的生长素水平，促进侧根的生长发育。
NPA和BFA分别能影响生长素的极性运输和囊泡运输，利用两种试剂处理IBA诱导的拟南芥植株，以了解和推测CuAOζ基因的位置。
1 材料与方法
1. 1 实验材料
以Columbia生态型拟南芥野生型（wild type, WT）、T-DNA插入CuAO缺失突变体（SALK_095214）为实验材料。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 拟南芥种子的消毒
先用75%的乙醇浸泡种子5 min，然后用无菌水冲洗2次，再用2%的次氯酸钠消毒10 min，用无菌水冲洗4-5次。消毒后的种子播种于无菌MS培养上。
MS培养基配方（100 ml）：0.44 g MS盐（Sigma），2%蔗糖，1.0%琼脂粉。121 ℃高温灭菌20 min，铺板于9 cm的无菌玻璃培养皿。
1. 2. 2 拟南芥植株的培养条件
4 °C环境春化3 d，置于光照强度为160 μmol photons m-2s-1、10/14 h（23 °C/18 °C）（白天/夜晚）的光周期、60%相对湿度的生长室内生长。一周后将幼苗移至土：蛭石（2：1）的混合而成的生长介质中。
1. 2. 3 过氧化氢染色
过氧化氢专一性的染料BES-H2O2-Ac购于日本Wako公司。母液溶解到DMSO配成20 mM母液，工作浓度为10 μM。不同处理的拟南芥幼苗在BES-H2O2-Ac溶液（用1 mM MES-Tris，pH 6.5稀释）染色10-30 min，然后用缓冲液洗3-5次，每次10 min。用Zeiss 780激光共聚焦显微镜观察绿色荧光，激发波长488 nm，吸收波长535 nm。
2 结果与分析
2．1 二胺氧化酶来源的H2O2正调控侧根发育
IBA能有效抑制拟南芥主根生长并促进侧根发生。我们将恒温培养6天的野生型（WT）拟南芥幼苗，放置于含有10 μM IBA的1/2 MS培养基的培养皿中处理，6天后，统计侧根密度及总长，以及主根长度。结果表明，IBA处理后，幼苗侧根密度和总长显著增加（图2.1.1A和B）。我们在IBA处理的同时分别加入二胺氧化酶的专一性抑制剂AG（aminoguanidine，氨基胍）或BEA（2-bromoethylamine，2-溴乙胺）。结果表明，在不加入IBA处理时，与对照相比，AG和BEA处理对根发育无显著作用；AG和BEA均明显抑制IBA诱导的侧根发育（图2.1.1A-C）。另外， H2O2的清除剂DMTU（Dimethylthiourea，二甲基硫脲）的抑制效果更明显，其主根长、侧根密度和侧根总长显著减少（图2.1.1A-C）。上述结果初步表明，二胺氧化酶来源的H2O2正调控IBA诱导的侧根发育。
图2.1.1 CuAO来源的H2O2调控IBA诱导的侧根发育
Fig. 2.1.1 Regulation of IBA-regulated root development by CuA *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
O-derived H2O2
生长6 d的拟南芥幼苗转移到不同培养基进行处理，处理7 d后统计侧根根长和侧根密度并拍照。The 6-day-old seedlings were transferred to different treatment medium for 7 d before measuring number and total length of lateral roots. Asterisks indicate that the mean value is significantly different from that of the control (*P < 0.05, **P < 0.01).
我们利用H2O2专一性的荧光染料BES-H2O2-Ac标记根部H2O2。结果表明，拟南芥根部皮层部分荧光值较高，其中伸长区的荧光较强；用10 μM IBA处理1 d后，根部H2O2含量显著上升。而加入二胺氧化酶抑制剂AG、BEA或H2O2清除剂DMTU后明显抑制了IBA诱导的H2O2浓度的升高（图2.1.2A-B）。
图2.1.2 野生型拟南芥根部H2O2分布和含量测定
Fig. 2.1.2 H2O2 distribution in developmental roots in wide-type Arabidopsis.
MS上生长7 d的幼苗，在IBA处理培养基（或加入AG，BEA和DMTU）处理24 h后，利用荧光染料BES-H2O2-Ac进行根部染色15 min，然后利用激光共聚焦拍照并统计根部荧光强度。生长10-14天的野生型幼苗进行侧根H2O2的测定。IBA，10 μM；AG，250 μM；BEA，250 μM；DMTU，500 μM。The 6-day-old seedlings were treated with IBA with or without AG, BEA and DMTU for 24 h before root staining by BES-H2O2-Ac. The lateral roots from 10 to 14-day-old seedlings were used for florescence assay of lateral roots by confocal microscope. IBA, 10 μM; AG, 250 μM; BEA, 250 μM; DMTU, 500 μM. The asterisks indicate that the mean value is significantly different from that of the control wihout IBA treatment (*P < 0.05)
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