对和厚朴酚敏感性不同的几种酵母菌株在细胞自噬方面的差异
对和厚朴酚敏感性不同的几种酵母菌株在细胞自噬方面的差异[20200614171609]
摘要： 3
1 材料与方法 4
1.1 菌株与试剂 4
1.2培养菌体 5
1.3提取质粒并酶切 5
1.3.1 大肠杆菌质粒的提取 5
1.3.2 酶切 5
1.3.2.1 SnaBI酶切载体pYH233 5
1.3.2.2纯化酶切产物 6
1.4整合酶切质粒到染色体上 6
1.5诱导自噬 6
1.5.1检查荧光 6
1.5.2诱导自噬 7
1.6 SPB4-DAmP 和OST1-DAmP分别诱导自噬1h,2h,3h 7
1.7 Western Blot定量检测GFP-Atg8的降解以及Ape1的成熟 7
1.7.1细胞的培养和自噬诱导 7
1.7.2荧光观察 7
1.7.3蛋白样品的制备 7
1.8 Western Blot 8
1.8.1SDS聚丙烯酰胺凝胶的制备 8
1.8.2蛋白的提取、上样和电泳 8
1.8.3转膜 8
1.8.4封闭 8
1.8.5 anti-GFP特异性的抗体结合 8
1.8.6 X-光片曝光、显影 8
1.8.7 anti-Ape1特异性的抗体结合 8
2 结果与分析 9
2.1 荧光观察 9
2.2 9
2.3 10
2.4 11
3 讨论 11
致谢 12
参考文献： 12
对和厚朴酚敏感性不同的几种酵母菌株在细胞自噬方面的差异
摘要： 细胞自噬是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程。该过程将一些损坏的蛋白或细胞器用双层膜结构的自噬小泡包裹后，送入溶酶体(动物）或液泡 （酵母和植物）中进行降解并得以循环利用。和厚朴酚是从厚朴中提取的中药单体物，对革兰氏阳性菌和丝状真菌有显著的抗菌活性。在以酿酒酵母作为模式真菌探讨和厚朴酚杀抑真菌机制时，发现和厚朴酚可以抑制野生型酵母中的细胞自噬过程，但不同的酵母突变体对同样浓度的和厚朴酚敏感性存在差别，有些表现为敏感，有些表现为抗性。本研究以对和厚朴酚敏感性不同的几种酵母菌株为材料，探讨他们在细胞自噬方面是否存在差异，以了解和厚朴酚是否通过影响酵母菌的细胞自噬过程来影响菌体的生长。研究结果对阐释和厚朴酚的作用机制具有一定的意义。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
关键字:和厚朴酚；细胞自噬；抗菌作用
目录
引言
引言
细胞自噬（Autophagy）是细胞利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程，是真核细胞特有的生命现象。一些蛋白质和细胞器通过自噬途径运输到溶酶体进行降解，它们通过平衡细胞合成和分解代谢以稳定细胞内环境。最近有学者对 HeLa细胞的研究发现，胱天蛋白酶(caspase)能够分解 ATG6 蛋白，而 ATG6 蛋白在自噬性细胞死亡中起重要作用，这表明胱天蛋白酶介导 ATG6蛋白的分解可将细胞凋亡和自噬现象联系起来，胱天蛋白酶活化后可通过抑制ATG蛋白而阻止细胞自噬的发生[1]。自噬在肿瘤发生、发展中起促进和抑制双重作用，在一定条件下可以相互转化。在用三苯氧胺治疗的乳腺癌 MCF-7细胞中发现，DRP-1的低表达可以降低饥饿水平和自噬。在 HeLa细胞中发现，DAPK的低表达可以降低 INF-γ 诱导的自噬[2]。与细胞凋亡相对应的细胞自噬过程在肿瘤生成及防治中的作用日益彰显。
已有一些有关和厚朴酚通过影响细胞凋亡抗肿瘤及其应用的报道，和厚朴酚通过不依赖p53的途径上调caspase-3、-7的表达，激活caspsases级联系统，诱导人结直肠癌RKO细胞凋亡[3]；在人多发性骨髓瘤细胞株中，和厚朴酚激活了caspase-3、-7、-8、-9并且促进线粒体释放凋亡诱导因子(AIF)到胞浆，从而激活了依赖caspase途径和不依赖caspase途径的凋亡[4]；和厚朴酚可诱导人的淋巴系白血病Molt-4B细胞、人的鳞癌细胞CH27、B细胞性慢性淋巴细胞白血病的肿瘤细胞凋亡[5-7]。和厚朴酚与小剂量的1，25-二轻维生素D或全反式维甲酸联合应用，可增强人早幼粒白血病细胞HL-60膜表面分化标记CD11b、CD14的表达，促进细胞分化，表现出协同作用[8]。
和厚朴酚(Honok *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
iol，HNK)是从厚朴中分离的带有烯丙基的连苯二酚类化合物，具有多种药理作用。在肿瘤防治方面，HNK在体内外对多种肿瘤具有诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤转移、抑制肿瘤血管形成和诱导肿瘤细胞分化等作用。目前已有报道部分抗肿瘤药物可以通过影响细胞自噬过程调控抗肿瘤效果。采用喜树碱处理的MCF7细胞，24 小时内细胞中有自噬泡样结构出现，并聚集于线粒体；而自噬抑制剂可促进线粒体去极化并且提高胱天蛋白酶-9的活性，并加速凋亡，提示自噬可延迟凋亡，将自噬抑制剂联合传统的化疗药对早期乳腺癌的治疗可能是一种潜在的方法[9]。和厚朴酚对革兰氏阳性菌、耐酸性菌、丝状真菌有显著的抗菌活性，对变形链球菌有更加显著的抗菌作用，对葡萄球菌的抑制作用最强。
本研究以单细胞模式生物酵母菌为材料，探讨和厚朴酚是否通过影响细胞自噬过程调控酵母菌的生长及死亡，对阐释和厚朴酚的药理作用及进一步开发利用具有重要的理论意义及应用价值。我进行毕业论文实习所在实验室的初步研究结果已显示和厚朴酚可以抑制细胞自噬过程并表现出剂量依赖性并筛选出部分对同样浓度的和厚朴酚具有不同敏感性的酵母突变体。
为了探讨和厚朴酚的抑菌机理及不同敏感性酵母突变体对和厚朴酚造成敏感性差异的原因，本研究将检测对和厚朴酚具有不同敏感性的酵母突变体中细胞自噬的情况。
1． 材料与方法
1.1 菌株与试剂
酵母菌株和质粒载体见下表。
酵母菌株
菌株编号 通用名 基因型 来源
YHY548 BY4741 MAT a his3-1 leu2Δ met15Δ ura3Δ 实验室保存
YEL360 BY4741, SPB4-DAmP Mutant Library
YEL479 BY4741, OST1-DAmP Mutant Library
YEL73 BY4741, PRE8-DAmP Mutant Library
YEL316 BY4741, ARH1-DAmP Mutant Library
YEL289 BY4741, TCP1-DAmP Mutant Library
YEL333 BY4741, SNM1-DAmP Mutant Library
质粒载体
载体编号 通用名 基因型 来源
pYH233 p1K-GFP-Atg8-406 实验室保存
本实验所用到的提取质粒的试剂为碧云天公司生产的质粒小量抽提试剂盒，纯化所用试剂来自OMEGA公司的核酸纯化试剂盒。
1.2培养菌体
1， 在YPD平板上划线接种野生型YHY548和突变体菌株（抗和厚朴酚型PRE8-DAmP, ARH1-DAmP, OST1-DAmP和对和厚朴酚敏感型TCP1-DAmP, SNM1-DAmP，SPB4-DAmP )，倒置在26℃培养箱培养3天。
2， 在LB+Amp平板上接种含有pYH233 (p1K-GFP-Atg8-406)的大肠杆菌，倒置在37℃培养箱培养1天。
1.3提取质粒并酶切
1.3.1 大肠杆菌质粒的提取
用碧云天的质粒小量抽提试剂盒提取质粒，具 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
体步骤如下：
1， 取过夜菌1.5ml，用5000g离心1min收集管内细菌沉淀，弃掉上清。重复上一步操作，每管共收集3ml过夜菌沉淀；
2， 每管加入250μl溶液Ⅰ，重悬细菌沉淀,确保沉淀完全散开，无可见细菌团块；
3， 每管加入250μl溶液Ⅱ，轻轻颠倒离心管4-6次，使细菌完全裂解，溶液透明；
4， 每管加入350μl溶液Ⅲ，随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生；最高速（13000rmp）室温离心10min；
5， 将上一步骤离心后的上清液倒入或吸入到质粒纯化柱内。最高速离心30-60s，倒弃收集管内液体；
6， 在质粒纯化柱内加入750μl溶液Ⅳ，最高速离心30-60s，洗去杂质，倒弃收集管内液体；
7， 最高速再离心1min，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。将质粒纯化柱置于1.5ml离心管上，加入50μl溶液Ⅴ至管内柱面上，放置1min；
8， 最高速离心1min，所得液体即为高纯度质粒
1.3.2 酶切
1.3.2.1 SnaB I酶切载体pYH233
SnaBI酶切质粒载体pYH233即GFP-Atg8基因，
反应体系如下：
10×SnaB I Basal Buffer 15μl
SnaBI 3μl
PYH233 75μl
5,涡旋 ,每个有菌体的离心管中加200ul混合液。
6,再在每个离心管中加入8ul纯化的GFP-Atg8 SnaBI 酶切产物和8ul ssDNA
摘要： 3
1 材料与方法 4
1.1 菌株与试剂 4
1.2培养菌体 5
1.3提取质粒并酶切 5
1.3.1 大肠杆菌质粒的提取 5
1.3.2 酶切 5
1.3.2.1 SnaBI酶切载体pYH233 5
1.3.2.2纯化酶切产物 6
1.4整合酶切质粒到染色体上 6
1.5诱导自噬 6
1.5.1检查荧光 6
1.5.2诱导自噬 7
1.6 SPB4-DAmP 和OST1-DAmP分别诱导自噬1h,2h,3h 7
1.7 Western Blot定量检测GFP-Atg8的降解以及Ape1的成熟 7
1.7.1细胞的培养和自噬诱导 7
1.7.2荧光观察 7
1.7.3蛋白样品的制备 7
1.8 Western Blot 8
1.8.1SDS聚丙烯酰胺凝胶的制备 8
1.8.2蛋白的提取、上样和电泳 8
1.8.3转膜 8
1.8.4封闭 8
1.8.5 anti-GFP特异性的抗体结合 8
1.8.6 X-光片曝光、显影 8
1.8.7 anti-Ape1特异性的抗体结合 8
2 结果与分析 9
2.1 荧光观察 9
2.2 9
2.3 10
2.4 11
3 讨论 11
致谢 12
参考文献： 12
对和厚朴酚敏感性不同的几种酵母菌株在细胞自噬方面的差异
摘要： 细胞自噬是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程。该过程将一些损坏的蛋白或细胞器用双层膜结构的自噬小泡包裹后，送入溶酶体
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
关键字:和厚朴酚；细胞自噬；抗菌作用
目录
引言
引言
细胞自噬（Autophagy）是细胞利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程，是真核细胞特有的生命现象。一些蛋白质和细胞器通过自噬途径运输到溶酶体进行降解，它们通过平衡细胞合成和分解代谢以稳定细胞内环境。最近有学者对 HeLa细胞的研究发现，胱天蛋白酶(caspase)能够分解 ATG6 蛋白，而 ATG6 蛋白在自噬性细胞死亡中起重要作用，这表明胱天蛋白酶介导 ATG6蛋白的分解可将细胞凋亡和自噬现象联系起来，胱天蛋白酶活化后可通过抑制ATG蛋白而阻止细胞自噬的发生[1]。自噬在肿瘤发生、发展中起促进和抑制双重作用，在一定条件下可以相互转化。在用三苯氧胺治疗的乳腺癌 MCF-7细胞中发现，DRP-1的低表达可以降低饥饿水平和自噬。在 HeLa细胞中发现，DAPK的低表达可以降低 INF-γ 诱导的自噬[2]。与细胞凋亡相对应的细胞自噬过程在肿瘤生成及防治中的作用日益彰显。
已有一些有关和厚朴酚通过影响细胞凋亡抗肿瘤及其应用的报道，和厚朴酚通过不依赖p53的途径上调caspase-3、-7的表达，激活caspsases级联系统，诱导人结直肠癌RKO细胞凋亡[3]；在人多发性骨髓瘤细胞株中，和厚朴酚激活了caspase-3、-7、-8、-9并且促进线粒体释放凋亡诱导因子(AIF)到胞浆，从而激活了依赖caspase途径和不依赖caspase途径的凋亡[4]；和厚朴酚可诱导人的淋巴系白血病Molt-4B细胞、人的鳞癌细胞CH27、B细胞性慢性淋巴细胞白血病的肿瘤细胞凋亡[5-7]。和厚朴酚与小剂量的1，25-二轻维生素D或全反式维甲酸联合应用，可增强人早幼粒白血病细胞HL-60膜表面分化标记CD11b、CD14的表达，促进细胞分化，表现出协同作用[8]。
和厚朴酚(Honok *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
iol，HNK)是从厚朴中分离的带有烯丙基的连苯二酚类化合物，具有多种药理作用。在肿瘤防治方面，HNK在体内外对多种肿瘤具有诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤转移、抑制肿瘤血管形成和诱导肿瘤细胞分化等作用。目前已有报道部分抗肿瘤药物可以通过影响细胞自噬过程调控抗肿瘤效果。采用喜树碱处理的MCF7细胞，24 小时内细胞中有自噬泡样结构出现，并聚集于线粒体；而自噬抑制剂可促进线粒体去极化并且提高胱天蛋白酶-9的活性，并加速凋亡，提示自噬可延迟凋亡，将自噬抑制剂联合传统的化疗药对早期乳腺癌的治疗可能是一种潜在的方法[9]。和厚朴酚对革兰氏阳性菌、耐酸性菌、丝状真菌有显著的抗菌活性，对变形链球菌有更加显著的抗菌作用，对葡萄球菌的抑制作用最强。
本研究以单细胞模式生物酵母菌为材料，探讨和厚朴酚是否通过影响细胞自噬过程调控酵母菌的生长及死亡，对阐释和厚朴酚的药理作用及进一步开发利用具有重要的理论意义及应用价值。我进行毕业论文实习所在实验室的初步研究结果已显示和厚朴酚可以抑制细胞自噬过程并表现出剂量依赖性并筛选出部分对同样浓度的和厚朴酚具有不同敏感性的酵母突变体。
为了探讨和厚朴酚的抑菌机理及不同敏感性酵母突变体对和厚朴酚造成敏感性差异的原因，本研究将检测对和厚朴酚具有不同敏感性的酵母突变体中细胞自噬的情况。
1． 材料与方法
1.1 菌株与试剂
酵母菌株和质粒载体见下表。
酵母菌株
菌株编号 通用名 基因型 来源
YHY548 BY4741 MAT a his3-1 leu2Δ met15Δ ura3Δ 实验室保存
YEL360 BY4741, SPB4-DAmP Mutant Library
YEL479 BY4741, OST1-DAmP Mutant Library
YEL73 BY4741, PRE8-DAmP Mutant Library
YEL316 BY4741, ARH1-DAmP Mutant Library
YEL289 BY4741, TCP1-DAmP Mutant Library
YEL333 BY4741, SNM1-DAmP Mutant Library
质粒载体
载体编号 通用名 基因型 来源
pYH233 p1K-GFP-Atg8-406 实验室保存
本实验所用到的提取质粒的试剂为碧云天公司生产的质粒小量抽提试剂盒，纯化所用试剂来自OMEGA公司的核酸纯化试剂盒。
1.2培养菌体
1， 在YPD平板上划线接种野生型YHY548和突变体菌株（抗和厚朴酚型PRE8-DAmP, ARH1-DAmP, OST1-DAmP和对和厚朴酚敏感型TCP1-DAmP, SNM1-DAmP，SPB4-DAmP )，倒置在26℃培养箱培养3天。
2， 在LB+Amp平板上接种含有pYH233 (p1K-GFP-Atg8-406)的大肠杆菌，倒置在37℃培养箱培养1天。
1.3提取质粒并酶切
1.3.1 大肠杆菌质粒的提取
用碧云天的质粒小量抽提试剂盒提取质粒，具 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
体步骤如下：
1， 取过夜菌1.5ml，用5000g离心1min收集管内细菌沉淀，弃掉上清。重复上一步操作，每管共收集3ml过夜菌沉淀；
2， 每管加入250μl溶液Ⅰ，重悬细菌沉淀,确保沉淀完全散开，无可见细菌团块；
3， 每管加入250μl溶液Ⅱ，轻轻颠倒离心管4-6次，使细菌完全裂解，溶液透明；
4， 每管加入350μl溶液Ⅲ，随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生；最高速（13000rmp）室温离心10min；
5， 将上一步骤离心后的上清液倒入或吸入到质粒纯化柱内。最高速离心30-60s，倒弃收集管内液体；
6， 在质粒纯化柱内加入750μl溶液Ⅳ，最高速离心30-60s，洗去杂质，倒弃收集管内液体；
7， 最高速再离心1min，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。将质粒纯化柱置于1.5ml离心管上，加入50μl溶液Ⅴ至管内柱面上，放置1min；
8， 最高速离心1min，所得液体即为高纯度质粒
1.3.2 酶切
1.3.2.1 SnaB I酶切载体pYH233
SnaBI酶切质粒载体pYH233即GFP-Atg8基因，
反应体系如下：
10×SnaB I Basal Buffer 15μl
SnaBI 3μl
PYH233 75μl
5,涡旋 ,每个有菌体的离心管中加200ul混合液。
6,再在每个离心管中加入8ul纯化的GFP-Atg8 SnaBI 酶切产物和8ul ssDNA
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