一株产凝乳酶的芽孢杆菌的筛选
一株产凝乳酶的芽孢杆菌的筛选[20200614171858]
摘要：本实验在传统纳豆生产方式上加以改进，得到富含γ-氨基丁酸（GABA）的纳豆，将纳豆冻干后打粉制成咀嚼片。用考马斯亮蓝法测定蛋白含量，用TAME法测定纳豆激酶（NK）活力，用纸电泳和高效液相色谱法测定GABA含量。研究发现，在该生产技术下，生产出的纳豆中纳豆激酶的活力与市场上出售的纳豆相比无显著差异，而GABA的含量显著高于市场上所售纳豆，制成咀嚼片后与发酵及冻干打粉后比较酶活有所降低。试验证明该方法可行，生产的咀嚼片除了能掩盖纳豆不易被人接受的特殊气味外，还富含GABA和NK活力，有很大的市场前景。
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关键字:纳豆激酶；γ-氨基丁酸；咀嚼片
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1试验材料 2
1.2主要试剂 2
1.3主要仪器 3
1.4试验方法 3
1.4.1发芽方法3
1.4.2发酵及制片方法4
1.5指标测定与方法 5
1.5.1纳豆粘液率测定4
1.5.2蛋白质含量测定4
1.5.3 TAME法测定纳豆激酶活性4
1.5.4 GABA含量测定4
1.5.5食品安全指标测定4
1.5.6感官评定4
2结果与分析5
2.1纳豆粘液率测定结果及分析5
2.2蛋白质与酶活5
2.3 GABA含量测定结果及分析6
2.4 安全指标测定结果7
2.5 感官评定结果及分析7
3讨论8
致谢8
参考文献8
富含GABA纳豆生产技术研究
引言
引言
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)，是哺乳动物中枢神经系统的抑制性神经递质，具有降低血压、改善脑机能、抗惊厥、预防和治疗癫痫、活化肾肝、促进精子受精等作用[1]。γ- 氨基丁酸在1883年就已被人工合成[2]，1950年Robert等[3]发现GABA存在于脑中，是由谷氨酸形成的。GABA在生物体内的合成代谢[4]存在两条路径，即GABA支路和多胺降解途径。正常条件下，植物体内GABA含量通常在0.03~2.00μmol/g鲜重之间[5, *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
6]，但当植物处于逆境环境中时，GABA的含量会迅速增加[7]，热激、缺氧、低温、盐胁迫等逆境均可以使GABA在植物中积累[8,9]。由于GABA在生物体内占有举足轻重的地位，因此其关键酶学性质及生理功能成了研究热点[10,11]。
纳豆激酶（Nattokinase，NK）作为一种功能性物质被广泛用在食品中，它能激活血液中的血纤溶酶原，从而溶解血栓，预防和治疗心脑血管疾病，其溶血栓能力明显强于临床上的治疗药物，高效安全、分子量小、可由消化道吸收、作用时间久、直接作用于纤维蛋白、造价低廉等优点，并且在体内半衰期长(6h～8h)、易于提取、价格低廉、无任何副作用。此外，纳豆激酶还具有抗致病菌、防癌抗癌阻止动脉粥样硬化、抗氧化延缓衰老等功能[12]。
1987 年，须见洋行博士从纳豆中提取出一种具有溶栓性质的酶，命名为纳豆激酶（nattokinase,NK）[13,14] ，根据其基因的DNA序列和氨基酸序列的一级结构，分离出单一肽，测得纳豆激酶由275个氨基酸组成。Mitsugu等[15]对大鼠进行实验，证明纳豆激酶的溶栓作用是血纤维蛋白溶酶纤溶能力的4倍以上，另外亦有实验证明纳豆激酶体外溶栓效果也非常明显。目前对纳豆激酶的研究主要集中在其稳定性[16]、溶栓作用[17]以及作为溶血栓药物[18]的开发上。
在国外，食品原料中GABA富集技术的研究已取得了显著成果，形成了成熟的富含γ-氨基丁酸保健食品的产业链[19]。而纳豆由于其特殊的氨味，难以被中国的消费者接受。本课题使用大豆为原料，使其先发芽富集GABA再接种纳豆菌，冻干粉碎之后做成咀嚼片可作为功能性保健品食用，其营养价值和功效大大提高，在中国市场上有很大的应用前景。
1 材料与方法
1.1 试验材料
大豆(云鹤YH-NJ)，产自中国东北吉林省，装于聚乙烯塑料袋，于-20℃贮藏于冰箱，直至使用。
1.2主要试剂
柠檬酸 分析纯 国药集团化学试剂有限公司
柠檬酸钠 分析纯 国药集团化学试剂有限公司
冰乙酸 分析纯 国药集团化学试剂有限公司
乙酸钠 分析纯 国药集团化学试剂有限公司
乙醇 分析纯 国药集团化学试剂有限公司
吡啶 分析纯 国药集团化学试剂有限公司
磷酸氢二钠 分析纯 国药集团化学试剂有限公司
磷酸二氢钠 分析纯 国药集团化学试剂有限公司
碳酸钠 分析纯 国药集团化学试剂有限公司
碳酸氢钠 分析纯 国药集团化学试剂有限公司
茚三酮 分析纯 国药集团化学试剂有限公司
五水合硫酸铜 分析纯 国药集团化学试剂有限公司
对二甲氨基苯磺酰氯 99% Sigma公司
乙腈 色谱纯 美国新天地
甲醇 分析纯 南京化学试剂有限公司
硫酸 98% 南京化学试剂有限公司
甲基苯磺酰-L-精氨酸甲酯 98% 阿拉丁
三氯醋酸 分析纯 国药集团化学试剂有限公司
高锰酸钾 分析纯 国药集团化学试剂有限公司
亚硫酸钠 分析纯 国药集团化学试剂有限公司
变色酸 分析纯 阿拉丁
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/> 大豆蛋白胨 生物试剂 青岛高科园海博生物技术有限公司
葡萄糖 分析纯 国药集团化学试剂有限公司
琼脂粉 生物试剂 国药集团化学试剂有限公司
牛血清白蛋白 生化试剂 上海蓝季科技发展有限公司
考马斯亮蓝G-250 生化试剂 国药集团上海化学试剂公司
1.3主要仪器
DHG–9030A型电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司
HH–6型数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司
LSHZ-300冷冻水浴恒温振荡器 江苏太仓市实验设备厂
JA2003型电子天平 上海精密科学仪器有限公司
UV–2802型紫外可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司
TDL–40B离心机 上海安亭科学仪器厂
H1650-W台式微量高速离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司
TG16-WS型离心机 长沙湘智离心机仪器有限公司
Orion818型pH测试仪 Orion Research, Inc.
PYX–9030A型隔水电热恒温发芽箱 上海跃进医疗器械厂
WH–3微型旋涡混合仪 上海沪西分析仪器厂
YB-1000A型高速多功能粉碎机 永康市速锋工贸有限公司
DYY–10C 型微电脑控制多用电泳仪 北京六一仪器厂
多功能活氧机BG–LJ30OA 北理国科臭氧应用技术有限公司
MUL 9000(B)-H-30型超纯水系统 昆山总馨机械有限公司
LDZX-30KBS立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂
图3产品不同阶段NK活力
纳豆发酵完成后在-20℃冰箱保存，其中的纳豆激酶比较稳定，经冷冻干燥、高速粉碎后，NK活力仍无显著性差异。但在制片过程中需经过60~70℃的高温，生产出的咀嚼NK活力相对减少。
2．3 GABA含量测定结果及分析
摘要：本实验在传统纳豆生产方式上加以改进，得到富含γ-氨基丁酸（GABA）的纳豆，将纳豆冻干后打粉制成咀嚼片。用考马斯亮蓝法测定蛋白含量，用TAME法测定纳豆激酶（NK）活力，用纸电泳和高效液相色谱法测定GABA含量。研究发现，在该生产技术下，生产出的纳豆中纳豆激酶的活力与市场上出售的纳豆相比无显著差异，而GABA的含量显著高于市场上所售纳豆，制成咀嚼片后与发酵及冻干打粉后比较酶活有所降低。试验证明该方法可行，生产的咀嚼片除了能掩盖纳豆不易被人接受的特殊气味外，还富含GABA和NK活力，有很大的市场前景。
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关键字:纳豆激酶；γ-氨基丁酸；咀嚼片
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1试验材料 2
1.2主要试剂 2
1.3主要仪器 3
1.4试验方法 3
1.4.1发芽方法3
1.4.2发酵及制片方法4
1.5指标测定与方法 5
1.5.1纳豆粘液率测定4
1.5.2蛋白质含量测定4
1.5.3 TAME法测定纳豆激酶活性4
1.5.4 GABA含量测定4
1.5.5食品安全指标测定4
1.5.6感官评定4
2结果与分析5
2.1纳豆粘液率测定结果及分析5
2.2蛋白质与酶活5
2.3 GABA含量测定结果及分析6
2.4 安全指标测定结果7
2.5 感官评定结果及分析7
3讨论8
致谢8
参考文献8
富含GABA纳豆生产技术研究
引言
引言
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)，是哺乳动物中枢神经系统的抑制性神经递质，具有降低血压、改善脑机能、抗惊厥、预防和治疗癫痫、活化肾肝、促进精子受精等作用[1]。γ- 氨基丁酸在1883年就已被人工合成[2]，1950年Robert等[3]发现GABA存在于脑中，是由谷氨酸形成的。GABA在生物体内的合成代谢[4]存在两条路径，即GABA支路和多胺降解途径。正常条件下，植物体内GABA含量通常在0.03~2.00μmol/g鲜重之间[5, *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
6]，但当植物处于逆境环境中时，GABA的含量会迅速增加[7]，热激、缺氧、低温、盐胁迫等逆境均可以使GABA在植物中积累[8,9]。由于GABA在生物体内占有举足轻重的地位，因此其关键酶学性质及生理功能成了研究热点[10,11]。
纳豆激酶（Nattokinase，NK）作为一种功能性物质被广泛用在食品中，它能激活血液中的血纤溶酶原，从而溶解血栓，预防和治疗心脑血管疾病，其溶血栓能力明显强于临床上的治疗药物，高效安全、分子量小、可由消化道吸收、作用时间久、直接作用于纤维蛋白、造价低廉等优点，并且在体内半衰期长(6h～8h)、易于提取、价格低廉、无任何副作用。此外，纳豆激酶还具有抗致病菌、防癌抗癌阻止动脉粥样硬化、抗氧化延缓衰老等功能[12]。
1987 年，须见洋行博士从纳豆中提取出一种具有溶栓性质的酶，命名为纳豆激酶（nattokinase,NK）[13,14] ，根据其基因的DNA序列和氨基酸序列的一级结构，分离出单一肽，测得纳豆激酶由275个氨基酸组成。Mitsugu等[15]对大鼠进行实验，证明纳豆激酶的溶栓作用是血纤维蛋白溶酶纤溶能力的4倍以上，另外亦有实验证明纳豆激酶体外溶栓效果也非常明显。目前对纳豆激酶的研究主要集中在其稳定性[16]、溶栓作用[17]以及作为溶血栓药物[18]的开发上。
在国外，食品原料中GABA富集技术的研究已取得了显著成果，形成了成熟的富含γ-氨基丁酸保健食品的产业链[19]。而纳豆由于其特殊的氨味，难以被中国的消费者接受。本课题使用大豆为原料，使其先发芽富集GABA再接种纳豆菌，冻干粉碎之后做成咀嚼片可作为功能性保健品食用，其营养价值和功效大大提高，在中国市场上有很大的应用前景。
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1.3主要仪器
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纳豆发酵完成后在-20℃冰箱保存，其中的纳豆激酶比较稳定，经冷冻干燥、高速粉碎后，NK活力仍无显著性差异。但在制片过程中需经过60~70℃的高温，生产出的咀嚼NK活力相对减少。
2．3 GABA含量测定结果及分析
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