oswak基因突变对水稻生长及细胞壁铜结合能力的影响
植物细胞壁关联蛋白激酶（Wall-associated kinases , WAKs）是一类特殊的类受体蛋白激酶（Receptor-like kinases , RLKs）, 不但具有跨膜结构域，且与细胞壁紧密相联。因其能够直接连接细胞壁与细胞质的特性以及可能的具备受体功能，WAK能够作为研究细胞壁信号分子到细胞质的跨膜传递很好的模型，同时在植物体的生长发育等方面也起到了重要的作用。本文采用不同浓度铜处理分别处理水稻野生型及WAK基因沉默株系，对其根系伸长量、生物量、气孔发育、细胞壁各组分糖醛酸含量及其对铜的吸附作用进行研究，研究结果表明高浓度铜胁迫下，相对于野生型，水稻WAK基因沉默株系更为敏感，根系伸长量、生物量、气孔发育受抑制显著。同时，沉默水稻的WAK基因能够导致其在铜胁迫下细胞壁各组分糖醛酸上升量减少，细胞壁各组分铜结合量减少，地上部与地下部细胞壁甲酯化程度显著增高。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 3
1.1 实验材料 3
1.1.1 植物材料 3
1.1.2 主要试剂 3
1.1.3 主要仪器设备 3
1.2 实验方法 3
1.2.1 水稻培养 3
1.2.2 铜胁迫处理 3
1.2.3 植株叶片气孔大小、气孔密度测定 3
1.2.4 植株生长的测定 3
1.2.5 细胞壁的提取与各组分的分离 3
1.2.6 糖醛酸含量的测定 4
1.2.7 铜含量的测定 4
1.2.8 细胞壁甲酯化程度测定 4
1.2.9 数据分析 4
2 结果与分析 4
2.1 铜处理对两种水稻植株生长的影响 4
2.2 WAK基因抑制对水稻气孔生长的影响 5
2.3 WAK基因抑制对水稻植株细胞壁各组分铜结合能力的影响 6
2.3.1 细胞壁各组分糖醛酸含量的变化 6
2.3.2 细胞壁各个组份铜结合量 7
2.4 WAK基因抑制 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
对水稻植株细胞壁甲酯化程度的影响 8
3 讨论 9
致谢 10
参考文献： 10
附录 12
OsWAK基因突变对水稻生长及细胞壁铜结合能力的影响
生命科学学院 生命基地122 翟芮
引言
引言
铜（Cu）是植物生长所需的重要微量元素，也是主要的环境污染物之一。近年来，随着人口数量的增长，矿产资源大量开采，工业农业的发展，Cu污染已成为全球面临的一个严重环境问题。过量的Cu会影响生物体的正常代谢从而对植物造成胁迫。最近有研究结果显示，铜胁迫可以诱导植物质膜NADP氧化酶活性，促进H2O2产生[1]。然而，植物是如何感应重金属胁迫包括铜胁迫并启动相应适应机制的信号途径至今仍不清楚。
细胞壁是植物细胞的重要组成部分，在维持植物细胞的形状、调节细胞的生长和防御及胁迫反应等方面发挥着重要作用。细胞壁与质膜的直接物质联系能够用于感知细胞壁结构的变化，这些联系对于细胞间的通信和植物发育起重要作用。细胞壁中只有一小部分蛋白被检测出有连接细胞壁与质膜的潜力，其中就包含类受体激酶（Receptorlike kinases , RLKs）[2]。植物细胞壁关联蛋白激酶（Wallassociated kinases , WAKs）是一类特殊的类受体蛋白激酶(RLKs)，其结构包括一个胞内丝苏氨酸激酶域、一个跨膜域和一个包含表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)重复序列的胞外域[3]。其中胞外域可通过与细胞壁成分果胶共价交联感知细胞壁变化，胞内域具有激酶活性可以将胞外信号通过磷酸化的方式进行传送[4]。由此，推测WAK可能能够通过介导细胞内外的信号传递来调控植物细胞对于胁迫的响应过程。
对拟南芥中5个WAK基因家族的成员的研究发现，其氨基酸的胞外域差异均较为明显。胞内激酶域的同源性为86%，表明该家族较为保守，可能在胞内介导相似的信号途径。而胞外域只有4064％的同源性，暗示胞外域可以结合大量不同的配基，用以接受不同的环境信号[5]。Park等人[6]发现一个可与WAK1特异结合的富含甘氨酸（Gly）的细胞壁蛋白AtGRP3（Glyrich protein），但其具体的生理功能还有待研究。果胶是另一个被发现的可与WAK结合的细胞壁分子；这种结合是细胞伸长所必需的，一些如病害、物理伤害等环境刺激能够诱导这种结合[7]。有研究证实，脱酯化果胶能够比酯化果胶结合更多的WAK1[8]。果胶中的糖醛酸残基可解离为带负电荷的羧基，使其可与金属离子结合。金属离子与果胶的结合，有可能影响到果胶与WAK的结合，从而进一步影响到WAK的表达和功能发挥。还有研究发现，在植物抵御病原物的防御反应中，WAK1也可作为细胞壁成分—寡聚半乳糖醛酸苷（Ologogalacturonides，OGs）的受体蛋白[9]。
另一方面，对WAK在细胞内的靶蛋白目前还所知甚少。Yang等[10]发现一个叶绿体中的氧相关增强蛋白（OEE2）能够与WAK1的激酶域结合，且以GRP3/WAK1依赖的方式被磷酸化，说明OEE2可能是GRP3/WAK1在胞内调节的靶蛋白之一。最近的研究结果发现，果胶与WAK2的结合既激活了与细胞壁合成相关的许多基因，又激活MAPK的表达[11]，这暗示了MAPK也可能是WAK的下游靶蛋白。同时，果胶与WAK的结合经研究发现与胞外Ca2+有关，胞外Ca2+在植物受到外界刺激时会产生变化，调控多种生理反应，因此，推测WAK能够通过与果胶结合后，能够感知植物细胞壁受到外界刺激后产生的变化如Ca2+浓度与果胶结构组成等，并将其传递至细胞内。这些推测都有待进一步的研究与研究。
WAK不仅仅存在于拟南芥中，2005年Zhang等人从粳稻品种日本晴中分离出125个属于水稻WAK/WAKL（OsWAK）基因家族的基因[12]，数量远多于拟南芥。相对于拟南芥中的WAKs家族功能研究，水稻中的研究显得更为复杂。对于水稻数据库中的125个WAKs基因的结构研究、表达与进化分析已完成，但由于其数量多且结构复杂，对其的功能研究还较少。有研究显示，抑制WAK1表达能够导致水稻叶片、旗叶、节间及花序数目减少从而引起植株矮小[13]；同时发现WAK1在抗稻瘟病过程中起到重要作用，但其相对的具体作用机制尚不清楚。
本实验室利用2DPAGE技术，发现过量Cu处理引起水稻体内蛋白质表达差异，其中细胞壁关联蛋白激酶的蛋白质表达量比对照增加了3.5倍[14]，这是水稻中过量Cu诱导WAK蛋白表达的首次鉴定。此结果与半定量RTPCR分析结果一致，表明WAK确实参与了水稻响应铜胁迫的过程。但WAK感受铜胁迫的诱导表达的方式，在水稻响应铜胁迫的过程中起到作用的环节，其胞外的配基及胞内的作用底物，与其他胁迫信号（如ROS、Ca2+）之间可能存在的关系等问题，还有待进一步的研究。
为此我们通过沉默水稻中OsWAK基因，观察并检测其生长相关生理指标及地上部与根部生物量、根系净伸长量的变化，同时通过检测水稻细胞壁内各组分即果胶、半纤维素和纤维素的糖醛酸含量、铜结合量以及细胞壁甲酯化程度，研究OsWAK基因对于水稻生长及细胞壁铜结合能力的影响，以进一步分析OsWAK在水稻响应铜胁迫的过程中起到的具体作用。这有利于揭示OsWAK协助植物生长与响应重金属胁迫的作用机制，对于农作物以及经济作物的生长及生产等方面均有帮助与指导意义。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 3
1.1 实验材料 3
1.1.1 植物材料 3
1.1.2 主要试剂 3
1.1.3 主要仪器设备 3
1.2 实验方法 3
1.2.1 水稻培养 3
1.2.2 铜胁迫处理 3
1.2.3 植株叶片气孔大小、气孔密度测定 3
1.2.4 植株生长的测定 3
1.2.5 细胞壁的提取与各组分的分离 3
1.2.6 糖醛酸含量的测定 4
1.2.7 铜含量的测定 4
1.2.8 细胞壁甲酯化程度测定 4
1.2.9 数据分析 4
2 结果与分析 4
2.1 铜处理对两种水稻植株生长的影响 4
2.2 WAK基因抑制对水稻气孔生长的影响 5
2.3 WAK基因抑制对水稻植株细胞壁各组分铜结合能力的影响 6
2.3.1 细胞壁各组分糖醛酸含量的变化 6
2.3.2 细胞壁各个组份铜结合量 7
2.4 WAK基因抑制 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
对水稻植株细胞壁甲酯化程度的影响 8
3 讨论 9
致谢 10
参考文献： 10
附录 12
OsWAK基因突变对水稻生长及细胞壁铜结合能力的影响
生命科学学院 生命基地122 翟芮
引言
引言
铜（Cu）是植物生长所需的重要微量元素，也是主要的环境污染物之一。近年来，随着人口数量的增长，矿产资源大量开采，工业农业的发展，Cu污染已成为全球面临的一个严重环境问题。过量的Cu会影响生物体的正常代谢从而对植物造成胁迫。最近有研究结果显示，铜胁迫可以诱导植物质膜NADP氧化酶活性，促进H2O2产生[1]。然而，植物是如何感应重金属胁迫包括铜胁迫并启动相应适应机制的信号途径至今仍不清楚。
细胞壁是植物细胞的重要组成部分，在维持植物细胞的形状、调节细胞的生长和防御及胁迫反应等方面发挥着重要作用。细胞壁与质膜的直接物质联系能够用于感知细胞壁结构的变化，这些联系对于细胞间的通信和植物发育起重要作用。细胞壁中只有一小部分蛋白被检测出有连接细胞壁与质膜的潜力，其中就包含类受体激酶（Receptorlike kinases , RLKs）[2]。植物细胞壁关联蛋白激酶（Wallassociated kinases , WAKs）是一类特殊的类受体蛋白激酶(RLKs)，其结构包括一个胞内丝苏氨酸激酶域、一个跨膜域和一个包含表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)重复序列的胞外域[3]。其中胞外域可通过与细胞壁成分果胶共价交联感知细胞壁变化，胞内域具有激酶活性可以将胞外信号通过磷酸化的方式进行传送[4]。由此，推测WAK可能能够通过介导细胞内外的信号传递来调控植物细胞对于胁迫的响应过程。
对拟南芥中5个WAK基因家族的成员的研究发现，其氨基酸的胞外域差异均较为明显。胞内激酶域的同源性为86%，表明该家族较为保守，可能在胞内介导相似的信号途径。而胞外域只有4064％的同源性，暗示胞外域可以结合大量不同的配基，用以接受不同的环境信号[5]。Park等人[6]发现一个可与WAK1特异结合的富含甘氨酸（Gly）的细胞壁蛋白AtGRP3（Glyrich protein），但其具体的生理功能还有待研究。果胶是另一个被发现的可与WAK结合的细胞壁分子；这种结合是细胞伸长所必需的，一些如病害、物理伤害等环境刺激能够诱导这种结合[7]。有研究证实，脱酯化果胶能够比酯化果胶结合更多的WAK1[8]。果胶中的糖醛酸残基可解离为带负电荷的羧基，使其可与金属离子结合。金属离子与果胶的结合，有可能影响到果胶与WAK的结合，从而进一步影响到WAK的表达和功能发挥。还有研究发现，在植物抵御病原物的防御反应中，WAK1也可作为细胞壁成分—寡聚半乳糖醛酸苷（Ologogalacturonides，OGs）的受体蛋白[9]。
另一方面，对WAK在细胞内的靶蛋白目前还所知甚少。Yang等[10]发现一个叶绿体中的氧相关增强蛋白（OEE2）能够与WAK1的激酶域结合，且以GRP3/WAK1依赖的方式被磷酸化，说明OEE2可能是GRP3/WAK1在胞内调节的靶蛋白之一。最近的研究结果发现，果胶与WAK2的结合既激活了与细胞壁合成相关的许多基因，又激活MAPK的表达[11]，这暗示了MAPK也可能是WAK的下游靶蛋白。同时，果胶与WAK的结合经研究发现与胞外Ca2+有关，胞外Ca2+在植物受到外界刺激时会产生变化，调控多种生理反应，因此，推测WAK能够通过与果胶结合后，能够感知植物细胞壁受到外界刺激后产生的变化如Ca2+浓度与果胶结构组成等，并将其传递至细胞内。这些推测都有待进一步的研究与研究。
WAK不仅仅存在于拟南芥中，2005年Zhang等人从粳稻品种日本晴中分离出125个属于水稻WAK/WAKL（OsWAK）基因家族的基因[12]，数量远多于拟南芥。相对于拟南芥中的WAKs家族功能研究，水稻中的研究显得更为复杂。对于水稻数据库中的125个WAKs基因的结构研究、表达与进化分析已完成，但由于其数量多且结构复杂，对其的功能研究还较少。有研究显示，抑制WAK1表达能够导致水稻叶片、旗叶、节间及花序数目减少从而引起植株矮小[13]；同时发现WAK1在抗稻瘟病过程中起到重要作用，但其相对的具体作用机制尚不清楚。
本实验室利用2DPAGE技术，发现过量Cu处理引起水稻体内蛋白质表达差异，其中细胞壁关联蛋白激酶的蛋白质表达量比对照增加了3.5倍[14]，这是水稻中过量Cu诱导WAK蛋白表达的首次鉴定。此结果与半定量RTPCR分析结果一致，表明WAK确实参与了水稻响应铜胁迫的过程。但WAK感受铜胁迫的诱导表达的方式，在水稻响应铜胁迫的过程中起到作用的环节，其胞外的配基及胞内的作用底物，与其他胁迫信号（如ROS、Ca2+）之间可能存在的关系等问题，还有待进一步的研究。
为此我们通过沉默水稻中OsWAK基因，观察并检测其生长相关生理指标及地上部与根部生物量、根系净伸长量的变化，同时通过检测水稻细胞壁内各组分即果胶、半纤维素和纤维素的糖醛酸含量、铜结合量以及细胞壁甲酯化程度，研究OsWAK基因对于水稻生长及细胞壁铜结合能力的影响，以进一步分析OsWAK在水稻响应铜胁迫的过程中起到的具体作用。这有利于揭示OsWAK协助植物生长与响应重金属胁迫的作用机制，对于农作物以及经济作物的生长及生产等方面均有帮助与指导意义。
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