osspik的功能初探以及亚细胞定位研究
钾离子是植物生长和发育不可缺少的条件，是必需的大量元素之一。K+在花粉萌发和花粉管生长过程中发挥非常重要的作用, K+参与调节花粉管的胞内膨压、膜电势和离子的电荷平衡等，同时K+离子的跨膜运动是由花粉粒和花粉管质膜上的钾通道和转运体介导的。对花粉质膜内向K+通道分子水平的鉴定为研究K+在花粉萌发和花粉管生长过程中的作用提供了重要依据。本研究主要通过克隆水稻基因OsSPIK，连接载体后，利用农杆菌侵染烟草的方法确定其亚细胞定位，同时证明OsSPIK基因的表达有助于提高钾吸收缺陷型酵母的K+吸收能力。本研究初步证明了OsSPIK作为一个质膜定位的钾通道蛋白，其可能做为人为调控花粉管生长的重要靶点。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料 2
1．1 实验材料 2
1．1．1 实验所用宿主菌及载体质粒 2
1．1．2 酶及试剂 3
1．1．3 培养基配制 3
2 实验方法 3
2.1 植物总RNA的提取与反转录 3
2.1.1 准备工作 3
2.1.2 RNA提取步骤 3
2.1.3 反转录步骤 4
2.2目的基因的克隆和载体构建 4
2.2.1目的片段的扩增 4
2.2.2 中间载体pEASYBlunt Zero 载体连接反应 5
2.2.3 热激法转化大肠杆菌感受态细胞 5
2.2.4 菌落PCR检测阳性克隆 5
2.2.5 质粒DNA提取 5
2.2.6 酶切检测OsSPIK pEASYBlunt Zero 6
2.2.7 OsSPIK与目的载体pSuper1300:GFP连接反应 6
2.3 OsSPIK的亚细胞定位 6
2.3.1 质粒DNA转化农杆菌及阳性克隆鉴定 6
2.3.2 农杆菌转染 7
2.3.3 激光共聚焦显微镜观察OsSPIK的亚细胞定位 7
2.3.4 OsSPIK的跨膜结构域预测 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
7
2.4 目的基因转录水平测试 7
2.4.1 基因组文库检索OsSPIK 7
2.4.2 RTPCR 7
2.5 钾营养缺陷型酵母互补实验 7
2.5.1 PEG法转化酵母菌株 8
3 结果与分析 8
3.1 结果 8
3.1.1 目的基因的克隆和载体构建 8
3.1.1.1目的基因的克隆 8
3.1.1.2 载体构建 8
3.1.2 OsSPIK的亚细胞定位 9
3.1.2.1 农杆菌转化 9
3.1.2.2 烟草侵染及OsSPIK的亚细胞定位 9
3.1.2.3 OsSPIK的跨膜结构域预测 10
3.1.3 目的基因转录水平测试 10
3.1.4 钾营养缺陷型酵母互补实验 11
3.1.5 OsSPIK 突变体材料的鉴定 11
3.2 分析 12
3.2.1 OsSPIK的亚细胞定位 12
3.2.2 OsSPIK基因转录水平 12
3.2.3 OsSPIK功能探索 12
致谢 12
参考文献： 13
OsSPIK的功能初探以及亚细胞定位研究
引言
引言: K+在花粉萌发和花粉管生长过程中发挥非常重要的作用[3] [5。K+参与调节花粉管的胞内膨压、膜电势和离子的电荷平衡[9]。K+离子的跨膜运动是由花粉粒和花粉管质膜上的钾通道和转运体介导的。利用膜片钳技术，在油菜 [6] [7]拟南芥[5]和百合[8] [4]的花粉粒原生质体质膜上都鉴定到内向或外向K+通道的存在。利用百合和沙梨的花粉管分离的原生质体中也可以鉴定到内向K+通道的存在[8][11]。
对花粉质膜内向K+通道分子水平的鉴定为研究K+在花粉萌发和花粉管生长过程中的作用提供了重要依据。拟南芥Shaker钾通道家族中的SPIK（Shaker pollen inward K+ channel，又被称为AKT6）在拟南芥花粉和花粉管中特异表达；将SPIK在哺乳动物COS7细胞中异源表达，利用膜片钳的方法可以记录到超极化激活的、具有时间和电压依赖性的内向K+电流。其TDNA插入突变体spik1的花粉粒内向钾电流受到了明显抑制，并且体外培养的spik1花粉管呈现畸形，并且生长速率显著慢于野生型[10]。另外，拟南芥TPK（tandempore K+ channels）家族中的AtTPK4被证明是花粉粒和花粉管质膜上定位的非电压依赖型钾离子通道，主要参与调控花粉管质膜的膜电位[2]。此外，对拟南芥花粉和花粉管基因表达芯片数据的分析表明，一些K+转运体在花粉和花粉管中特异表达或高丰度表达，例如拟南芥CHX转运体家族和KT/KUP/HAK转运体家族中的部分成员，推测这些转运体可能在维持胞内pH和K+动态平衡方面发挥重要作用[13] [14] [15]。近年来，K+被报道在花粉管生长导向和花粉管进入胚珠后的破裂过程中发挥重要作用，对高等植物完成受精过程至关重要。一种胚珠助细胞分泌蛋白ZmES4能够激活玉米Shaker家族成员KZM1，降低KZM1通道开放的时间依赖性；这有利于增强K+内流，促使花粉管胞内K+积累和膨压升高，最终引起花粉管破裂[1]。
1 材料
1．1 实验材料
1．1．1 实验所用宿主菌及载体质粒
（1） pEASYBlunt Zero Cloning Vector:购自Beijing TransGen Biotech公司,与OsSPIK基因连接做中间载体。
（2）pSuper1300:GFP：目的载体，用于观测基因OsSPIK的亚细胞定位。
（3） 根癌农杆菌菌株GV3101由本实验室保存。
（4） TOP10大肠杆菌E. Coli感受态细胞：购自TIANGEN公司。
1．1．2 酶及试剂
（5） 限制性内切酶SpeⅠ和SmaⅠ：酶切鉴定OsSPIK pEASYBlunt Zero
Phanta Max SuperFidelity DNA Polymerase (1 U/μl)：购自Vazyme公司，用于PCR扩增OsSPIK基因
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料 2
1．1 实验材料 2
1．1．1 实验所用宿主菌及载体质粒 2
1．1．2 酶及试剂 3
1．1．3 培养基配制 3
2 实验方法 3
2.1 植物总RNA的提取与反转录 3
2.1.1 准备工作 3
2.1.2 RNA提取步骤 3
2.1.3 反转录步骤 4
2.2目的基因的克隆和载体构建 4
2.2.1目的片段的扩增 4
2.2.2 中间载体pEASYBlunt Zero 载体连接反应 5
2.2.3 热激法转化大肠杆菌感受态细胞 5
2.2.4 菌落PCR检测阳性克隆 5
2.2.5 质粒DNA提取 5
2.2.6 酶切检测OsSPIK pEASYBlunt Zero 6
2.2.7 OsSPIK与目的载体pSuper1300:GFP连接反应 6
2.3 OsSPIK的亚细胞定位 6
2.3.1 质粒DNA转化农杆菌及阳性克隆鉴定 6
2.3.2 农杆菌转染 7
2.3.3 激光共聚焦显微镜观察OsSPIK的亚细胞定位 7
2.3.4 OsSPIK的跨膜结构域预测 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
7
2.4 目的基因转录水平测试 7
2.4.1 基因组文库检索OsSPIK 7
2.4.2 RTPCR 7
2.5 钾营养缺陷型酵母互补实验 7
2.5.1 PEG法转化酵母菌株 8
3 结果与分析 8
3.1 结果 8
3.1.1 目的基因的克隆和载体构建 8
3.1.1.1目的基因的克隆 8
3.1.1.2 载体构建 8
3.1.2 OsSPIK的亚细胞定位 9
3.1.2.1 农杆菌转化 9
3.1.2.2 烟草侵染及OsSPIK的亚细胞定位 9
3.1.2.3 OsSPIK的跨膜结构域预测 10
3.1.3 目的基因转录水平测试 10
3.1.4 钾营养缺陷型酵母互补实验 11
3.1.5 OsSPIK 突变体材料的鉴定 11
3.2 分析 12
3.2.1 OsSPIK的亚细胞定位 12
3.2.2 OsSPIK基因转录水平 12
3.2.3 OsSPIK功能探索 12
致谢 12
参考文献： 13
OsSPIK的功能初探以及亚细胞定位研究
引言
引言: K+在花粉萌发和花粉管生长过程中发挥非常重要的作用[3] [5。K+参与调节花粉管的胞内膨压、膜电势和离子的电荷平衡[9]。K+离子的跨膜运动是由花粉粒和花粉管质膜上的钾通道和转运体介导的。利用膜片钳技术，在油菜 [6] [7]拟南芥[5]和百合[8] [4]的花粉粒原生质体质膜上都鉴定到内向或外向K+通道的存在。利用百合和沙梨的花粉管分离的原生质体中也可以鉴定到内向K+通道的存在[8][11]。
对花粉质膜内向K+通道分子水平的鉴定为研究K+在花粉萌发和花粉管生长过程中的作用提供了重要依据。拟南芥Shaker钾通道家族中的SPIK（Shaker pollen inward K+ channel，又被称为AKT6）在拟南芥花粉和花粉管中特异表达；将SPIK在哺乳动物COS7细胞中异源表达，利用膜片钳的方法可以记录到超极化激活的、具有时间和电压依赖性的内向K+电流。其TDNA插入突变体spik1的花粉粒内向钾电流受到了明显抑制，并且体外培养的spik1花粉管呈现畸形，并且生长速率显著慢于野生型[10]。另外，拟南芥TPK（tandempore K+ channels）家族中的AtTPK4被证明是花粉粒和花粉管质膜上定位的非电压依赖型钾离子通道，主要参与调控花粉管质膜的膜电位[2]。此外，对拟南芥花粉和花粉管基因表达芯片数据的分析表明，一些K+转运体在花粉和花粉管中特异表达或高丰度表达，例如拟南芥CHX转运体家族和KT/KUP/HAK转运体家族中的部分成员，推测这些转运体可能在维持胞内pH和K+动态平衡方面发挥重要作用[13] [14] [15]。近年来，K+被报道在花粉管生长导向和花粉管进入胚珠后的破裂过程中发挥重要作用，对高等植物完成受精过程至关重要。一种胚珠助细胞分泌蛋白ZmES4能够激活玉米Shaker家族成员KZM1，降低KZM1通道开放的时间依赖性；这有利于增强K+内流，促使花粉管胞内K+积累和膨压升高，最终引起花粉管破裂[1]。
1 材料
1．1 实验材料
1．1．1 实验所用宿主菌及载体质粒
（1） pEASYBlunt Zero Cloning Vector:购自Beijing TransGen Biotech公司,与OsSPIK基因连接做中间载体。
（2）pSuper1300:GFP：目的载体，用于观测基因OsSPIK的亚细胞定位。
（3） 根癌农杆菌菌株GV3101由本实验室保存。
（4） TOP10大肠杆菌E. Coli感受态细胞：购自TIANGEN公司。
1．1．2 酶及试剂
（5） 限制性内切酶SpeⅠ和SmaⅠ：酶切鉴定OsSPIK pEASYBlunt Zero
Phanta Max SuperFidelity DNA Polymerase (1 U/μl)：购自Vazyme公司，用于PCR扩增OsSPIK基因
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