多菌灵降解菌株ths的分离鉴定及其降解特性的研究
：在长期施用多菌灵的土壤中经过富集培养，分离纯化得到一株多菌灵降解菌株THS，根据其生理生化特性及16SrRNA基因序列比较分析，将其鉴定为Mycobacterium sp.。菌株在pH为6.0-7.0左右时生长良好，为好氧菌，具有多粘菌素B及克林霉素的抗性，且对低浓度呋喃妥因有抗性。在多菌灵浓度为50 mg·L-1的无机盐培养基中，菌株THS可将多菌灵作为唯一碳源生长，72h内对多菌灵的降解率为95%，在碱性条件下降解率较高，高浓度的多菌灵能影响菌株THS的降解效果。以已报道的多菌灵降解酶mheI的基因序列为基础，设计引物，用PCR的方式对目的片段进行克隆，得到多菌灵降解酶基因。经过比对发现其与已知Nocardioides sp. SG-4G中的基因序列同源性为99%。经过染色体步移的方法获得菌株THS的mheI基因及上游片段，并进行ORF分析，在mheI基因上游ORF5与Transposase [Arthrobacter gangotriensis Lz1y]的相似性为79%，故推测可能与基因的水平转移有关。
目录
摘要 IV
关键词 IV
ABSTRACT IV
KEY WORDS IV
引 言 1
1 材料与方法 1
1.1 培养基与试剂 1
1.2 菌株与质粒 2
1.3 多菌灵降解菌的分离、筛选及鉴定 2
1.3.1 多菌灵降解菌的分离 2
1.3.2 多菌灵降解菌的培养特征及生理生化鉴定 2
1.3.3 降解菌株16SrRNA基因序列的鉴定 2
1.3.4 降解菌株系统发育地位的测定 4
1.3.5 降解菌株生长量的测定 4
1.3.6 多菌灵含量的测定 4
1.4 多菌灵降解菌株的降解特性及代谢途径的研究 4
1.4.1 菌体生长量的测定 4
1.4.2 种子液的培养 4
1.4.3 代谢产物的测定 5
1.4.4 多菌灵降解酶基因的引物设计和PCR扩增 5
1.5多菌灵降解酶基因mheI的侧翼序列扩增及分析 5
1.5.1 侧翼序列
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
SEFAPCR引物设计和PCR扩增 5
1.5.2 序列分析 6
2 结果与分析 6
2.1多菌灵降解菌的分离、筛选及鉴定 6
2.1.1 多菌灵降解菌株的分离 6
2.1.2 降解菌株的形态学鉴定 7
2.1.3 降解菌株16SrRNA基因序列鉴定 7
2.1.4 降解菌株系统进化分析 7
2.1.5 环境条件对降解菌株生长的影响 9
2.2多菌灵降解菌株的降解特性及代谢途径的研究 12
2.2.1 菌株THS的生长与多菌灵降解的关系 12
2.2.2 多菌灵起始浓度对菌株THS降解多菌灵的影响 12
2.2.3 pH对菌株THS降解多菌灵的影响 13
2.2.4 验证多菌灵代谢产物 13
2.2.5 多菌灵降解酶基因mheI的克隆 14
2.3 多菌灵降解酶基因mheI的侧翼序列扩增及分析 15
2.3.1 侧翼序列的扩增及分析 15
3 讨论 16
附 录 17
1.菌株THS 16SrRNA序列 17
2.菌株THS中的mheI基因 17
3.上游扩增序列 18
致 谢 21
参考文献 22
多菌灵降解菌株THS的分离、鉴定及其降解特性的研究
生物基地111班 赵超然
引言
多菌灵是一种高效低毒的广谱杀菌剂，属于氯甲基酸酯类农药，广泛用于农业和园艺[1]，可用来防治植物作物的真菌病害（如半知菌、多子囊菌等[2])，是苯菌灵、氰菌灵、甲基托布津的水解产物和活性成分。多菌灵的主要是通过干扰脱氧核糖核酸的合成[3]以达成杀菌目的。研究表明苯菌灵在土壤中能够迅速转化为多菌灵[45]。多菌灵在环境中半衰期长[6]，如小麦土壤中多菌灵的半衰期为26.60~34.50 d[7]，可长期残留于施用部位达到积累产生危害，对哺乳动物有一定的毒害作用，有致癌、致畸、致突变的可能性，从而引起免疫功能下降和染色体畸变，影响后代的繁殖[89]。
多菌灵的化学性质稳定，光解是自然界中多菌灵的降解途径之一。Ricard Panadés等[10]研究了在紫外线照射的条件下，不同浓度的溶解氧和pH条件（1、5、7、8、11）对多菌灵的光降解性能的影响。在高压汞灯下和有机溶剂中多菌灵以不同的速率光解，在不同pH 的缓冲液中光解速率为: pH4＞pH9＞pH7[11]。由此证明，光解效率是与光源的发射光谱、反应介质以及反应体系等相关的。
在降解的众多途径中，生物降解起着重要的作用，其主要是通过微生物的降解来实现 [12]。多菌灵降解产物主要为2氨基苯并咪唑和5羟基苯并咪唑2氨基甲酸甲酯[13]。
目前已报道的多菌灵相关降解菌株有红球菌属Rhodococcus sp.[14]、短小芽孢杆菌Bacillus Pumilus sp.[15]、罗尔斯通氏菌Ralstonia sp. [16]、木霉菌属Trichonderma sp.[17]、诺卡氏菌Nocardioides sp.SG4G[18]、巴西固氮螺菌Azospirillum brasilense[19]。
整理资料发现，国内外学者对多菌灵的生物降解研究主要集中在筛选高效降解菌株，并研究其生物学特性，以确定最佳降解条件，达到丰富多菌灵降解菌资源的目的[20]。在分子水平的研究数目极少，仅少数将工程菌构建成功。但对于菌株的降解机理及降解酶基因的克隆等分子方面的工作研究较少。由于多菌灵在土壤中的累积而产生的对环境、生物的破坏，生物修复由于可使其降低对污染位点的干扰或破坏，减少污染转移[21]而更具有优势，得到研究人员的青睐，多菌灵的生物降解成为研究热点。因此，筛选、分离降解多菌灵的菌株，研究其生物学特性和降解特性，可以为其在生物修复中的应用提供理论依据，从而为我国的环保事业做出贡献。
本实验从长期被多菌灵污染的土壤中分离出一株多菌灵高效降解菌株，根据菌株的生理生化特征并结合16S rRNA基因相似性序列比对，鉴定其系统发育地位。根据不同情况下降解多菌灵的效果，研究其降解特性，并进一步推断其代谢产物和降解途径，并在分子水平上对其相关降解酶基因进行研究。
1 材料与方法
1.1 培养基与试剂
多菌灵原药（有效成分含量为99%），由江苏新沂农药厂馈赠；2氨基苯并咪唑（纯度98%）和2羟基苯并咪唑(纯度98%)购自百灵威科技有限公司。
基础盐培养基MSM(gL1)：NaCl 0.50g，(NH4)2SO4 1.00g，K2HPO4 1.50g，KH2PO4 0.50g，MgSO47H2O 0.20g，去离子水1000 mL，pH7.0。
富集分离培养基: 将无碳培养基中添加50mgL1的多菌灵原药，作为培养基中的唯一碳源。
LB 培养基 (gL1): 胰蛋白胨 10.00g, 酵母粉 5.00g, NaCI 10.00g,去离子水 1000mL。
目录
摘要 IV
关键词 IV
ABSTRACT IV
KEY WORDS IV
引 言 1
1 材料与方法 1
1.1 培养基与试剂 1
1.2 菌株与质粒 2
1.3 多菌灵降解菌的分离、筛选及鉴定 2
1.3.1 多菌灵降解菌的分离 2
1.3.2 多菌灵降解菌的培养特征及生理生化鉴定 2
1.3.3 降解菌株16SrRNA基因序列的鉴定 2
1.3.4 降解菌株系统发育地位的测定 4
1.3.5 降解菌株生长量的测定 4
1.3.6 多菌灵含量的测定 4
1.4 多菌灵降解菌株的降解特性及代谢途径的研究 4
1.4.1 菌体生长量的测定 4
1.4.2 种子液的培养 4
1.4.3 代谢产物的测定 5
1.4.4 多菌灵降解酶基因的引物设计和PCR扩增 5
1.5多菌灵降解酶基因mheI的侧翼序列扩增及分析 5
1.5.1 侧翼序列
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
SEFAPCR引物设计和PCR扩增 5
1.5.2 序列分析 6
2 结果与分析 6
2.1多菌灵降解菌的分离、筛选及鉴定 6
2.1.1 多菌灵降解菌株的分离 6
2.1.2 降解菌株的形态学鉴定 7
2.1.3 降解菌株16SrRNA基因序列鉴定 7
2.1.4 降解菌株系统进化分析 7
2.1.5 环境条件对降解菌株生长的影响 9
2.2多菌灵降解菌株的降解特性及代谢途径的研究 12
2.2.1 菌株THS的生长与多菌灵降解的关系 12
2.2.2 多菌灵起始浓度对菌株THS降解多菌灵的影响 12
2.2.3 pH对菌株THS降解多菌灵的影响 13
2.2.4 验证多菌灵代谢产物 13
2.2.5 多菌灵降解酶基因mheI的克隆 14
2.3 多菌灵降解酶基因mheI的侧翼序列扩增及分析 15
2.3.1 侧翼序列的扩增及分析 15
3 讨论 16
附 录 17
1.菌株THS 16SrRNA序列 17
2.菌株THS中的mheI基因 17
3.上游扩增序列 18
致 谢 21
参考文献 22
多菌灵降解菌株THS的分离、鉴定及其降解特性的研究
生物基地111班 赵超然
引言
多菌灵是一种高效低毒的广谱杀菌剂，属于氯甲基酸酯类农药，广泛用于农业和园艺[1]，可用来防治植物作物的真菌病害（如半知菌、多子囊菌等[2])，是苯菌灵、氰菌灵、甲基托布津的水解产物和活性成分。多菌灵的主要是通过干扰脱氧核糖核酸的合成[3]以达成杀菌目的。研究表明苯菌灵在土壤中能够迅速转化为多菌灵[45]。多菌灵在环境中半衰期长[6]，如小麦土壤中多菌灵的半衰期为26.60~34.50 d[7]，可长期残留于施用部位达到积累产生危害，对哺乳动物有一定的毒害作用，有致癌、致畸、致突变的可能性，从而引起免疫功能下降和染色体畸变，影响后代的繁殖[89]。
多菌灵的化学性质稳定，光解是自然界中多菌灵的降解途径之一。Ricard Panadés等[10]研究了在紫外线照射的条件下，不同浓度的溶解氧和pH条件（1、5、7、8、11）对多菌灵的光降解性能的影响。在高压汞灯下和有机溶剂中多菌灵以不同的速率光解，在不同pH 的缓冲液中光解速率为: pH4＞pH9＞pH7[11]。由此证明，光解效率是与光源的发射光谱、反应介质以及反应体系等相关的。
在降解的众多途径中，生物降解起着重要的作用，其主要是通过微生物的降解来实现 [12]。多菌灵降解产物主要为2氨基苯并咪唑和5羟基苯并咪唑2氨基甲酸甲酯[13]。
目前已报道的多菌灵相关降解菌株有红球菌属Rhodococcus sp.[14]、短小芽孢杆菌Bacillus Pumilus sp.[15]、罗尔斯通氏菌Ralstonia sp. [16]、木霉菌属Trichonderma sp.[17]、诺卡氏菌Nocardioides sp.SG4G[18]、巴西固氮螺菌Azospirillum brasilense[19]。
整理资料发现，国内外学者对多菌灵的生物降解研究主要集中在筛选高效降解菌株，并研究其生物学特性，以确定最佳降解条件，达到丰富多菌灵降解菌资源的目的[20]。在分子水平的研究数目极少，仅少数将工程菌构建成功。但对于菌株的降解机理及降解酶基因的克隆等分子方面的工作研究较少。由于多菌灵在土壤中的累积而产生的对环境、生物的破坏，生物修复由于可使其降低对污染位点的干扰或破坏，减少污染转移[21]而更具有优势，得到研究人员的青睐，多菌灵的生物降解成为研究热点。因此，筛选、分离降解多菌灵的菌株，研究其生物学特性和降解特性，可以为其在生物修复中的应用提供理论依据，从而为我国的环保事业做出贡献。
本实验从长期被多菌灵污染的土壤中分离出一株多菌灵高效降解菌株，根据菌株的生理生化特征并结合16S rRNA基因相似性序列比对，鉴定其系统发育地位。根据不同情况下降解多菌灵的效果，研究其降解特性，并进一步推断其代谢产物和降解途径，并在分子水平上对其相关降解酶基因进行研究。
1 材料与方法
1.1 培养基与试剂
多菌灵原药（有效成分含量为99%），由江苏新沂农药厂馈赠；2氨基苯并咪唑（纯度98%）和2羟基苯并咪唑(纯度98%)购自百灵威科技有限公司。
基础盐培养基MSM(gL1)：NaCl 0.50g，(NH4)2SO4 1.00g，K2HPO4 1.50g，KH2PO4 0.50g，MgSO47H2O 0.20g，去离子水1000 mL，pH7.0。
富集分离培养基: 将无碳培养基中添加50mgL1的多菌灵原药，作为培养基中的唯一碳源。
LB 培养基 (gL1): 胰蛋白胨 10.00g, 酵母粉 5.00g, NaCI 10.00g,去离子水 1000mL。
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