ppcbel植物瞬时表达载体和真核表达载体的构建与验证
疫霉是一类包含很多植物病原菌的真核生物，可引起很多作物发生灾难性病害。在植物与病原菌互作的过程中，植物通过模式识别受体（PRRs）识别病原相关模式分子（pathogen-associated molecular pattern，PAMP）来触发自身的免疫反应（PAMP-triggered immunity,PTI）。植物病原菌烟草寄生疫霉（Phytophthora parasitica var. nicotianae）是一种能对茄科植物造成严重危害的病原菌，其细胞壁中含有一种被命名为CBEL的病原相关模式分子（PAMP），因此，研究CBEL在植物上触发防卫反应的机制，对于作物生产过程中抵抗病原菌的研究具有很高的价值。在本文研究中，我们构建了PpCBEL植物瞬时表达载体使其在本氏烟上瞬时表达，并构建了真核表达载体，在体外表达纯化PpCBEL蛋白以便于后续研究。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 Phytophthora parasitica var. Nicotianae RNA的提取及逆转录2
1.1.1 Phytophthora parasitica var. Nicotianae RNA的提取 2
1.1.2 Phytophthora parasitica var. Nicotianae RNA的逆转录2
1.2大肠杆菌感受态细胞的制备3
1.3 大肠杆菌感受态细胞的转化3
1.4 植物表达载体的构建3
1.5 PCR验证体系4
1.6农杆菌电击感受态细胞的制备4
1.7农杆菌电击感受态的转化4
1.8 农杆菌介导的烟草瞬时表达5
1.9 烟草瞬时表达蛋白的提取与检测5
1.9.1 烟草总蛋白的提取5
1.9.2 蛋白质SDSPAGE电泳5
1.9.3 Western Blot检测6
1.10 重组目的蛋白酵母表达载体的构建及线性化6
1.11 毕赤酵母电击感受态的制备7
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
1.12 毕赤酵母感受态的电击转化7
1.13 PCR检测重组基因表型7
2 结果与分析7
2.1 PpCBEL的克隆7
2.2 植物表达载体的构建，菌落PCR验证8
2.3 烟草瞬时表达，western blot检测结果8
2.4 酵母表达载体线性化9
2.5 酵母转化，菌落PCR验证9
3 讨论10致谢10
参考文献10
附录A PpCBEL大肠杆菌转化子序列与PpCBEL序列比对11
PpCBEL植物瞬时表达载体和真核表达载体的构建与验证
引言
引言
植物在自然界中总是会面临各种各样的威胁，比如各种植物病原菌和害虫，植物病原菌主要包括病毒、类病毒、细菌、真菌等。由于植物不断的受到这些因素的攻击，因此植物与这些病原微生物之间建立了各种互作关系。在植物与病原物长期的协同进化过程中，植物自身进化出一套强有力的防卫系统，被称为植物免疫系统。
植物先天免疫反应中的第一层防御系统，是通过植物细胞表面存在的模式识别受体（PatternRecognition Receptors,PRRs）识别病原相关模式分子（Pathogenassociated Molecular Patterns,PAMPs）来激活植物的基础免疫，引起植物的局部和全身的免疫识别，被称为PAMPTriggered Immunity（PTI）。病原相关模式分子是一类受到植物强烈负向选择的高度保守的蛋白质，广泛存在于病原菌中[1][2]。病原菌的PAMPs信号会被植物的PRRs所感知，通过PRRs胞外结构域和胞内激酶结构将信号传递至植物细胞内部，激活一系列的免疫反应，包括使Ca2+释放从而导致质膜两侧的质子流改变[3]，激活MAPK级联反应[4]，活性氧迸发，胼胝质和细胞壁木质素的积累、激素水平变化，过敏性细胞坏死等，从而有效减弱病原菌的侵染[5]。
植物可以识别来自不同病原菌的不同病原相关模式分子[6]。如细菌中的PAMPs延伸因子、鞭毛蛋白和肽聚糖PGN[7][8]；真菌中的PAMPs几丁质、无毒基因Avel肽段和木聚糖酶等[9][10]；卵菌中的PAMPs β葡萄糖、激发素、糖基水解酶和谷氨酰胺转移酶等[11]。
植物病原菌烟草寄生疫霉（Phytophthora parasitica var. nicotianae）是一种能对茄科植物造成严重危害的病原菌，其中有一种蛋白质被称为CBEL，它就是一种病原体相关模式分子（PAMPs），推测可以被植物上的模式识别受体（PRRs）所识别。该蛋白是植物防御功能和类凝集素活动的激发子，是纤维素表面黏连和分化所必须的物质，并且参与疫霉细胞壁的形成[12]。CBEL是疫霉细胞壁中不可缺少的一种成分，所以在进化过程中是高度保守的。因此研究其在植物中的识别受体对于作物生产过程中抵抗病原卵菌具有很高的价值。本研究中我们构建了PpCBEL植物瞬时表达载体使其在本氏烟上瞬时表达，并构建了真核表达载体，在体外表达纯化PpCBEL蛋白以便于后续研究。
1、材料与方法
1.1 Phytophthora parasitica var. Nicotianae RNA的提取及逆转录
1.1.1 Phytophthora parasitica var. Nicotianae RNA的提取
RNA的提取参照Total RNA Purification System试剂盒（Invitrogen）提供的方法进行，具体操作步骤如下：
取1000μl裂解液和10μlβ巯基乙醇加入1.5mL EP管。
取适量样品用滤纸充分压干后加入液氮充分研磨，将研磨后的粉末加入装有裂解液的EP管中，振荡充分后室温放置。
14000rpm离心510min，取上清800μl于一新1.5mL的EP管中。
向其中加入等体积的70%无水乙醇。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 Phytophthora parasitica var. Nicotianae RNA的提取及逆转录2
1.1.1 Phytophthora parasitica var. Nicotianae RNA的提取 2
1.1.2 Phytophthora parasitica var. Nicotianae RNA的逆转录2
1.2大肠杆菌感受态细胞的制备3
1.3 大肠杆菌感受态细胞的转化3
1.4 植物表达载体的构建3
1.5 PCR验证体系4
1.6农杆菌电击感受态细胞的制备4
1.7农杆菌电击感受态的转化4
1.8 农杆菌介导的烟草瞬时表达5
1.9 烟草瞬时表达蛋白的提取与检测5
1.9.1 烟草总蛋白的提取5
1.9.2 蛋白质SDSPAGE电泳5
1.9.3 Western Blot检测6
1.10 重组目的蛋白酵母表达载体的构建及线性化6
1.11 毕赤酵母电击感受态的制备7
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1.12 毕赤酵母感受态的电击转化7
1.13 PCR检测重组基因表型7
2 结果与分析7
2.1 PpCBEL的克隆7
2.2 植物表达载体的构建，菌落PCR验证8
2.3 烟草瞬时表达，western blot检测结果8
2.4 酵母表达载体线性化9
2.5 酵母转化，菌落PCR验证9
3 讨论10致谢10
参考文献10
附录A PpCBEL大肠杆菌转化子序列与PpCBEL序列比对11
PpCBEL植物瞬时表达载体和真核表达载体的构建与验证
引言
引言
植物在自然界中总是会面临各种各样的威胁，比如各种植物病原菌和害虫，植物病原菌主要包括病毒、类病毒、细菌、真菌等。由于植物不断的受到这些因素的攻击，因此植物与这些病原微生物之间建立了各种互作关系。在植物与病原物长期的协同进化过程中，植物自身进化出一套强有力的防卫系统，被称为植物免疫系统。
植物先天免疫反应中的第一层防御系统，是通过植物细胞表面存在的模式识别受体（PatternRecognition Receptors,PRRs）识别病原相关模式分子（Pathogenassociated Molecular Patterns,PAMPs）来激活植物的基础免疫，引起植物的局部和全身的免疫识别，被称为PAMPTriggered Immunity（PTI）。病原相关模式分子是一类受到植物强烈负向选择的高度保守的蛋白质，广泛存在于病原菌中[1][2]。病原菌的PAMPs信号会被植物的PRRs所感知，通过PRRs胞外结构域和胞内激酶结构将信号传递至植物细胞内部，激活一系列的免疫反应，包括使Ca2+释放从而导致质膜两侧的质子流改变[3]，激活MAPK级联反应[4]，活性氧迸发，胼胝质和细胞壁木质素的积累、激素水平变化，过敏性细胞坏死等，从而有效减弱病原菌的侵染[5]。
植物可以识别来自不同病原菌的不同病原相关模式分子[6]。如细菌中的PAMPs延伸因子、鞭毛蛋白和肽聚糖PGN[7][8]；真菌中的PAMPs几丁质、无毒基因Avel肽段和木聚糖酶等[9][10]；卵菌中的PAMPs β葡萄糖、激发素、糖基水解酶和谷氨酰胺转移酶等[11]。
植物病原菌烟草寄生疫霉（Phytophthora parasitica var. nicotianae）是一种能对茄科植物造成严重危害的病原菌，其中有一种蛋白质被称为CBEL，它就是一种病原体相关模式分子（PAMPs），推测可以被植物上的模式识别受体（PRRs）所识别。该蛋白是植物防御功能和类凝集素活动的激发子，是纤维素表面黏连和分化所必须的物质，并且参与疫霉细胞壁的形成[12]。CBEL是疫霉细胞壁中不可缺少的一种成分，所以在进化过程中是高度保守的。因此研究其在植物中的识别受体对于作物生产过程中抵抗病原卵菌具有很高的价值。本研究中我们构建了PpCBEL植物瞬时表达载体使其在本氏烟上瞬时表达，并构建了真核表达载体，在体外表达纯化PpCBEL蛋白以便于后续研究。
1、材料与方法
1.1 Phytophthora parasitica var. Nicotianae RNA的提取及逆转录
1.1.1 Phytophthora parasitica var. Nicotianae RNA的提取
RNA的提取参照Total RNA Purification System试剂盒（Invitrogen）提供的方法进行，具体操作步骤如下：
取1000μl裂解液和10μlβ巯基乙醇加入1.5mL EP管。
取适量样品用滤纸充分压干后加入液氮充分研磨，将研磨后的粉末加入装有裂解液的EP管中，振荡充分后室温放置。
14000rpm离心510min，取上清800μl于一新1.5mL的EP管中。
向其中加入等体积的70%无水乙醇。
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