drosophiladrosha的克隆与表达
microRNA是一种非编码RNA分子，长度约21~22个核苷酸，可以通过与靶mRNA结合调节基因的转录后表达。Drosha是一种核糖核酸酶，在microRNA的表达中起着修饰miRNA初级转录产物的作用。根据现有的研究结果可以知道，Drosha能够切割miRNA的初级转录产物pri-miRNA，却不清楚具体的修饰机制。为了进一步研究microRNA的修饰机理，本实验以人的293T细胞为实验材料，利用载体连接、转化、菌落PCR、核酸电泳、Quick Change、细胞转染、蛋白印迹等试验方法，进行Drosophila Drosha的克隆与表达，为后续实验研究奠定基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验材料 2
1.1.1 待插入的基因片段.............................................................2
1.1.2 载体.................................................................................2
1.1.3 感受态细胞......................................................................2
1.1.4 细胞............................................................................2
1.1.5 引物............................................................................2
1.2 实验方法 2
1.2.1 质粒提取2
1.2.2 制备感受态细胞2
1.2.3 连接3
1.2.4 转化3
1.2.5 菌落PCR................................ *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
.....................................3
1.2.6 核酸电泳........................................................................3
1.2.7 切胶回收...........................................................................3
1.2.8 Quick Change.............................................................3
1.2.9 Blast......................................................................4
1.2.10 转染.............................................................................4
1.2.11 Western Blot.............................................................4
2 结果与分析4
2.1 Drosophila Drosha的克隆..........................4
2.1.1 分段克隆Drosha基因片段.....................................................4
2.1.2 连接及构建Drosha基因片段................................................5
2.1.3 Quick Change............................................................................7
2.1.4 将Drosha片段克隆到pTOPO载体上........................................8
2.2 Drosophila Drosha的表达................................................................10
3 讨论 10
致谢11
参考文献12
附录...........................12 Drosophila Drosha的克隆与表达
生物技术 方 源
引言
引言
小RNA分子是非编码的RNA分子（noncoding RNA, ncRNA），其控制着真核细胞的许多功能，影响基因表达、细胞周期和个体发育等多种行为[1,2]。miRNA是一类长度很短的非编码调控单链小分子RNA，长度约21~22个核苷酸（少数小于20个核苷酸），能够通过与靶mRNA特异性的碱基配对引起靶mRNA的降解或者抑制其翻译，从而对基因进行转录后表达的调控[3]。miRNA由一段具有发夹环结构的长度为70~80个核苷酸的miRNA前体（premiRNA）剪切后生成。它通过与其目标mRNA分子的3端非编码区域（3’untranslatedregion，3UTR）互补导致该mRNA分子的翻译受到抑制[4,5]。
Drosha是一种核糖核酸酶，miRNA的初级转录产物primiRNA在细胞核中被一种蛋白复合体切割成为前体miRNA（premiRNA），而Drosha就是这种蛋白质复合体的主要组成部分。被Drosha切割后的miRNA再由另一种核糖核酸酶Dicer加工，最后形成成熟的miRNA。
果蝇是一种重要的模式生物，常被应用在miRNA的研究中。本实验就是以人的293T细胞为实验材料、以果蝇的Drosha基因为研究对象，构建并表达Drosophila Drosha基因，为后期进一步研究miRNA的合成机制奠定基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验材料 2
1.1.1 待插入的基因片段.............................................................2
1.1.2 载体.................................................................................2
1.1.3 感受态细胞......................................................................2
1.1.4 细胞............................................................................2
1.1.5 引物............................................................................2
1.2 实验方法 2
1.2.1 质粒提取2
1.2.2 制备感受态细胞2
1.2.3 连接3
1.2.4 转化3
1.2.5 菌落PCR................................ *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
.....................................3
1.2.6 核酸电泳........................................................................3
1.2.7 切胶回收...........................................................................3
1.2.8 Quick Change.............................................................3
1.2.9 Blast......................................................................4
1.2.10 转染.............................................................................4
1.2.11 Western Blot.............................................................4
2 结果与分析4
2.1 Drosophila Drosha的克隆..........................4
2.1.1 分段克隆Drosha基因片段.....................................................4
2.1.2 连接及构建Drosha基因片段................................................5
2.1.3 Quick Change............................................................................7
2.1.4 将Drosha片段克隆到pTOPO载体上........................................8
2.2 Drosophila Drosha的表达................................................................10
3 讨论 10
致谢11
参考文献12
附录...........................12 Drosophila Drosha的克隆与表达
生物技术 方 源
引言
引言
小RNA分子是非编码的RNA分子（noncoding RNA, ncRNA），其控制着真核细胞的许多功能，影响基因表达、细胞周期和个体发育等多种行为[1,2]。miRNA是一类长度很短的非编码调控单链小分子RNA，长度约21~22个核苷酸（少数小于20个核苷酸），能够通过与靶mRNA特异性的碱基配对引起靶mRNA的降解或者抑制其翻译，从而对基因进行转录后表达的调控[3]。miRNA由一段具有发夹环结构的长度为70~80个核苷酸的miRNA前体（premiRNA）剪切后生成。它通过与其目标mRNA分子的3端非编码区域（3’untranslatedregion，3UTR）互补导致该mRNA分子的翻译受到抑制[4,5]。
Drosha是一种核糖核酸酶，miRNA的初级转录产物primiRNA在细胞核中被一种蛋白复合体切割成为前体miRNA（premiRNA），而Drosha就是这种蛋白质复合体的主要组成部分。被Drosha切割后的miRNA再由另一种核糖核酸酶Dicer加工，最后形成成熟的miRNA。
果蝇是一种重要的模式生物，常被应用在miRNA的研究中。本实验就是以人的293T细胞为实验材料、以果蝇的Drosha基因为研究对象，构建并表达Drosophila Drosha基因，为后期进一步研究miRNA的合成机制奠定基础。
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