蜜蜂螺原体(spiroplasmamelliferumch1)几丁质酶基因的克隆表达及其蛋白纯化
：蜜蜂螺原体病严重制约着我国养蜂业的发展，为了解蜜蜂螺原体几丁质酶在螺原体致病过程中的作用，本研究克隆了蜜蜂螺原体Spiroplasma melliferum CH-1中几丁质酶基因chiA、构建pET28a-chiA表达载体，最后在大肠杆菌中得到由IPTG诱导表达的完整外源蛋白，并通过NTA-Ni2+ 柱对该酶蛋白进行纯化。本文结果为进一步研究螺原体几丁质酶的相关特性，蜜蜂螺原体的致病机理以及蜜蜂的螺原体死亡病的防治提供了重要的信息。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 材料 2
1.1.1 菌株、质粒和试剂 2
1.1.2 培养基和溶液 2
1.2 方法 2
1.2.1 Spiroplasma melliferum CH1菌株基因组DNA的提取 2
1.2.2 几丁质酶基因chiA的扩增 3
1.2.3 几丁质酶基因chiA克隆表达，构建pET28achiA表达载体 3
1.2.4 重组质粒pET28achiA在大肠杆菌中的原核表达 4
1.2.5 重组蛋白的诱导表达及纯化 4
2 结果与分析 5
2.1 pET28achiA构建及表达 5
2.2 重组蛋白的诱导表达及纯化 6
3 讨论 8
3.1 pET28achiA的构建及扩增方法探究 8
3.2 蜜蜂螺原体外源几丁质酶蛋白纯化意义 8
致谢 8
参考文献 9
蜜蜂螺原体(Spiroplasma melliferum CH1)几丁质酶基因 的克隆表达及其蛋白纯化
引言
引言
螺原体(spiroplasma)是一类基本形态为螺旋形原核微生物[12]，无细胞壁，但在系统发育分析上属革兰氏阳性菌，具有滤过性，能独立生活和自我复制，属于细菌域(Bacteria)，厚壁菌门(Firmicutes)，柔膜菌纲(Mollicutes)，虫原体目(En
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
tomoplasmatale)，螺原体科(Spiroplasmataceae)，螺原体属(Spiroplasma)。目前发现的螺原体有34个血清组，其中血清组Ⅰ有9个亚组，血清组Ⅷ和ⅩⅥ各有3个亚组，但仅38个种给与拉丁文双名并被详细描述。螺原体主要存在于昆虫体内、植物体内和植物花表面，它和宿主的关系可分为互惠共生(mutualism)、寄生(parasitism）和共栖(commensalism)三种，其中大多数为共栖关系[3, 4, 5]。
1976年，在美国Maryland州首次发现由Spiroplasma melliferum引起的一种蜜蜂病害——螺原体死亡病(spiroplasmosis)；在国内，陈永萱等于1988年首次从患“爬蜂病”的蜜蜂体内分离到螺原体菌株CH1，并对其基本生物学特性作了详细的研究[6]。迄今为止，致病螺原体已报到过多种，其基本生物学特性也有详细研究，但致病机制方面的研究仍然很少。蜜蜂螺原体病在我国养蜂地区普遍发生，严重制约着我国养蜂业的发展。通过测定引起我国蜜蜂“爬蜂病”的主要病原S. melliferum CH1基因组草图，与非致病螺原体比较，可以探索CH1中可能存在的几种致病因子，例如几丁质酶基因在S. melliferum中属于特有基因，但在已测序并报道的其他螺原体基因组中并未发现与这个酶有关的基因[7]。
大多数几丁质酶生产菌对真菌具有拮抗作用，且多数几丁质酶在离体情况下也能抑制真菌的生长，这些发现使得人们开始着手研究几丁质酶的生物防治。1990年，Takeshi Watanake从一株环状芽孢杆菌(Bacillus circulans WL12)中分离出6种几丁质酶，对真菌(如酵母菌)细胞壁的分解具有协同作用[8]。Dixit等研究几丁质酶的作用时发现，它参与改变蓓带夜蛾(Mamestra configurata)围食膜中几丁质的物理和化学性质，而这一生化过程不仅改变几丁质的纤维结构，而且对围食膜蛋白的结合程度、围食膜的完整性和孔隙率产生影响 [9]。据此研究人员推测几丁质酶在蜜蜂螺原体侵入蜜蜂肠道过程中起到了关键作用[10]。
我国在动物支原体(Mycoplasma)和植物支原体(植原体Phytoplasma)已有较深入的研究，对于同属柔膜菌纲的导致中华绒螯蟹颤抖病的螺原体Spiroplasma eriocheiris也取得突破性进展，但是对于蜜蜂螺原体S. melliferum的致病机理研究却很少，研究力量十分薄弱。蜜蜂螺原体几丁质酶的理化性质、空间结构以及功能域较其他细菌有何不同，其在螺原体致病过程中发挥的作用等都有待深入研究。
本项目在研究我国蜜蜂螺原体种类和致病性以及测定了蜜蜂螺原体S. melliferum CH1的全基因组序列（草图）与功能注释的基础上，通过生物信息学分析克隆表达出与致病性相关的chiA基因编码的几丁质酶蛋白，分析其可能的结构、功能及定位，为进一步研究后续几丁质酶蛋白相关性质，蜜蜂螺原体的致病机理以及蜜蜂的螺原体死亡病的防治提供了重要的信息。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、质粒和试剂
试剂：限制性内切酶BamHI和XhoI、T4 DNA连接酶；PCR引物由捷瑞公司合成，质粒DNA小量制备试剂盒、柱式琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购于捷瑞公司；NiNTA亲和树脂由南京基蛋生物技术有限公司馈赠；对硝基乙酰苯胺（分析纯）；对硝基苯胺（分析纯）等其它试剂均为进口或国产分析纯。
1.1.2 培养基和溶液
R2培养基[11]；LB液体培养基(1 L)：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g；LB 固体培养基(1 L)：在LB液体培养基中加入20 g/L的琼脂，在LB培养基使用前加入终浓度为50 mg/L的卡那霉素。0.2 mol/L PB (1 L)：磷酸氢二钠58 g，磷酸二氢钠6 g；Binding Buffer：0.05 mol/L PB，0.5 mol/L NaCl，0.02 mol/L 咪唑；Elution Buffer：0.05 mol/L PB，0.5 mol/L NaCl，0.5 mol/L咪唑。
1.2 方法
1.2.1 Spiroplasma melliferum CH1菌株基因组DNA的提取
将菌株Spiroplasma melliferum CH1接种于液体R2培养基中，32℃培养2 d。然后，取2 mL 菌液13 000 r/min，离心15 min，去上清，收集菌体，然后，采用CTAB/NaCl方法提取螺原体基因组[1213]。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 材料 2
1.1.1 菌株、质粒和试剂 2
1.1.2 培养基和溶液 2
1.2 方法 2
1.2.1 Spiroplasma melliferum CH1菌株基因组DNA的提取 2
1.2.2 几丁质酶基因chiA的扩增 3
1.2.3 几丁质酶基因chiA克隆表达，构建pET28achiA表达载体 3
1.2.4 重组质粒pET28achiA在大肠杆菌中的原核表达 4
1.2.5 重组蛋白的诱导表达及纯化 4
2 结果与分析 5
2.1 pET28achiA构建及表达 5
2.2 重组蛋白的诱导表达及纯化 6
3 讨论 8
3.1 pET28achiA的构建及扩增方法探究 8
3.2 蜜蜂螺原体外源几丁质酶蛋白纯化意义 8
致谢 8
参考文献 9
蜜蜂螺原体(Spiroplasma melliferum CH1)几丁质酶基因 的克隆表达及其蛋白纯化
引言
引言
螺原体(spiroplasma)是一类基本形态为螺旋形原核微生物[12]，无细胞壁，但在系统发育分析上属革兰氏阳性菌，具有滤过性，能独立生活和自我复制，属于细菌域(Bacteria)，厚壁菌门(Firmicutes)，柔膜菌纲(Mollicutes)，虫原体目(En
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
tomoplasmatale)，螺原体科(Spiroplasmataceae)，螺原体属(Spiroplasma)。目前发现的螺原体有34个血清组，其中血清组Ⅰ有9个亚组，血清组Ⅷ和ⅩⅥ各有3个亚组，但仅38个种给与拉丁文双名并被详细描述。螺原体主要存在于昆虫体内、植物体内和植物花表面，它和宿主的关系可分为互惠共生(mutualism)、寄生(parasitism）和共栖(commensalism)三种，其中大多数为共栖关系[3, 4, 5]。
1976年，在美国Maryland州首次发现由Spiroplasma melliferum引起的一种蜜蜂病害——螺原体死亡病(spiroplasmosis)；在国内，陈永萱等于1988年首次从患“爬蜂病”的蜜蜂体内分离到螺原体菌株CH1，并对其基本生物学特性作了详细的研究[6]。迄今为止，致病螺原体已报到过多种，其基本生物学特性也有详细研究，但致病机制方面的研究仍然很少。蜜蜂螺原体病在我国养蜂地区普遍发生，严重制约着我国养蜂业的发展。通过测定引起我国蜜蜂“爬蜂病”的主要病原S. melliferum CH1基因组草图，与非致病螺原体比较，可以探索CH1中可能存在的几种致病因子，例如几丁质酶基因在S. melliferum中属于特有基因，但在已测序并报道的其他螺原体基因组中并未发现与这个酶有关的基因[7]。
大多数几丁质酶生产菌对真菌具有拮抗作用，且多数几丁质酶在离体情况下也能抑制真菌的生长，这些发现使得人们开始着手研究几丁质酶的生物防治。1990年，Takeshi Watanake从一株环状芽孢杆菌(Bacillus circulans WL12)中分离出6种几丁质酶，对真菌(如酵母菌)细胞壁的分解具有协同作用[8]。Dixit等研究几丁质酶的作用时发现，它参与改变蓓带夜蛾(Mamestra configurata)围食膜中几丁质的物理和化学性质，而这一生化过程不仅改变几丁质的纤维结构，而且对围食膜蛋白的结合程度、围食膜的完整性和孔隙率产生影响 [9]。据此研究人员推测几丁质酶在蜜蜂螺原体侵入蜜蜂肠道过程中起到了关键作用[10]。
我国在动物支原体(Mycoplasma)和植物支原体(植原体Phytoplasma)已有较深入的研究，对于同属柔膜菌纲的导致中华绒螯蟹颤抖病的螺原体Spiroplasma eriocheiris也取得突破性进展，但是对于蜜蜂螺原体S. melliferum的致病机理研究却很少，研究力量十分薄弱。蜜蜂螺原体几丁质酶的理化性质、空间结构以及功能域较其他细菌有何不同，其在螺原体致病过程中发挥的作用等都有待深入研究。
本项目在研究我国蜜蜂螺原体种类和致病性以及测定了蜜蜂螺原体S. melliferum CH1的全基因组序列（草图）与功能注释的基础上，通过生物信息学分析克隆表达出与致病性相关的chiA基因编码的几丁质酶蛋白，分析其可能的结构、功能及定位，为进一步研究后续几丁质酶蛋白相关性质，蜜蜂螺原体的致病机理以及蜜蜂的螺原体死亡病的防治提供了重要的信息。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、质粒和试剂
试剂：限制性内切酶BamHI和XhoI、T4 DNA连接酶；PCR引物由捷瑞公司合成，质粒DNA小量制备试剂盒、柱式琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购于捷瑞公司；NiNTA亲和树脂由南京基蛋生物技术有限公司馈赠；对硝基乙酰苯胺（分析纯）；对硝基苯胺（分析纯）等其它试剂均为进口或国产分析纯。
1.1.2 培养基和溶液
R2培养基[11]；LB液体培养基(1 L)：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g；LB 固体培养基(1 L)：在LB液体培养基中加入20 g/L的琼脂，在LB培养基使用前加入终浓度为50 mg/L的卡那霉素。0.2 mol/L PB (1 L)：磷酸氢二钠58 g，磷酸二氢钠6 g；Binding Buffer：0.05 mol/L PB，0.5 mol/L NaCl，0.02 mol/L 咪唑；Elution Buffer：0.05 mol/L PB，0.5 mol/L NaCl，0.5 mol/L咪唑。
1.2 方法
1.2.1 Spiroplasma melliferum CH1菌株基因组DNA的提取
将菌株Spiroplasma melliferum CH1接种于液体R2培养基中，32℃培养2 d。然后，取2 mL 菌液13 000 r/min，离心15 min，去上清，收集菌体，然后，采用CTAB/NaCl方法提取螺原体基因组[1213]。
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