水稻耐盐突变体的生理鉴定及遗传分析
水稻耐盐突变体的生理鉴定及遗传分析[20200614170037]
摘要：土壤盐渍化是制约世界农业发展的主要环境因子之一。因此，如何开发利用盐碱地，提高盐渍化土地上的作物产量，已成为一个紧迫而重大的研究课题。本实验以水稻日本晴经EMS诱变获得的耐盐突变体st1（salt tolerance 1）为试验材料，对盐胁迫下st1突变体的重要生理生化指标进行分析，包括：生物量、地上部与地下部的Na+、K+、含量等，发现st1突变体在盐胁迫下，相比日本晴野生型有着较高的K+/Na+和生物量。并通过st1与其野生型日本晴杂交，鉴定此耐盐基因的显隐性，确定耐盐性状是由单个隐性基因控制的。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
关键字:耐盐突变体；st1；生理鉴定；遗传分析。
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key word 3
引言 3
1. 材料与方法 4
1.1 材料 4
1.2 耐盐性鉴定方法 4
1.2.1 材料培养 4
1.2.2 盐胁迫处理 4
1.2.3 生理测定方法 4
1.3 遗传分析方法 5
2. 结果与分析 5
2.1 st1与野生型日本晴苗期耐盐性表型比较 5
2.2.盐胁迫对st1地上部与地下部鲜重含量的影响 6
2.3.盐胁迫对st1地上部与地下部Ka+、Na+及Ka+/Na+的影响 9
2.4.突变体st1的遗传分析 12
3. 讨论 13
3.1 st1耐盐性生理基础 13
3.2.st1突变体的遗传分析 13
致谢 13
参考文献 13
水稻耐盐突变体的生理鉴定与遗传分析
引言
土壤盐渍化是制约世界农业发展的主要环境因子之一。据联合国粮农组织（FAO）统计，全球有盐渍土超过8亿hm2，占总陆地面积的10%。全世界大约有20%的灌溉土地（0.45亿hm2）不同程度地遭到盐渍化的危害。而中国是盐渍土分布广泛的国家之一，各类盐渍土总面积约1亿hm2[1]，严重制约了我国农业生产的发展。因此，如何开发利用盐碱地，提高盐渍化土地上的作物产量，已成为一个紧迫而重大的研究课题。
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，总种植面积超过1.48亿hm2，是半数世界人口赖以生存的主要食物。由于水稻种植常常依赖于灌溉，而不合理的灌溉促使地下水中的盐分沿土壤 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
毛管孔隙上升并在地表积累，引起土壤次生盐渍化。因此，在水稻种植地区，盐渍化成为普遍的土壤问题，极大限制了水稻生产。严重情况下，盐污染几乎完全阻碍了大面积土地上水稻的生长。面对如此严峻的形势，在合理灌溉，预防土壤盐渍化加重的同时，有必要培育高度耐盐的优良水稻品种，以适应和改善当前不断恶化的土壤环境。
水稻耐盐性是受多基因控制的数量性状，遗传基础较为复杂。水稻属盐敏感作物，其耐盐遗传资源贫乏。国际水稻所筛选了全世界9万余份品（系），发现最耐盐的水稻品种（Pokkali）的耐盐性也不及普通小麦或大麦，且大多数野生稻的耐盐性也十分有限[2]（Akbar, 1986; Akbar et al, 1987）。近年来，有人提出通过诱导耐盐性水稻突变体的方法来解决这个问题[5][4]（Flowers, 2004; Flowers and Yeo, 1995)。一方面，良好的突变体材料是水稻耐盐性遗传改良的宝贵资源，可以直接为育种实践服务。另一方面，更重要的是，耐盐性或盐敏感性突变体可以为耐盐性相关基因的克隆以及功能分析提供重要材料，而耐盐性分子机理的不断揭示必然会进一步加速水稻耐盐新品种培育的进程。因此，诱导水稻耐盐性相关突变体材料，克隆耐盐性相关基因，对认识水稻的耐盐机理以及育种改良均具有重要意义。
水稻耐盐性属于数量性状遗传，受多基因控制[5](Lin et al., 2004)。虽然目前已经克隆了很多耐盐性相关基因，但要全面地理解植物适应盐胁迫的分子机制，目前所知道的还远远不够。突变体一直是水稻遗传和育种研究的重要材料，尤其是在水稻基因组测序工作完成之后，通过筛选鉴定突变体材料，进而分离克隆突变基因的研究方式，已成为世界上研究水稻基因功能的主要手段之一。
在水稻的耐盐性方面，国内早期的一些研究也曾尝试利用水稻突变体进行耐盐性相关基因的定位克隆工作。张耕耘等[6]（1994）对九个EMS诱变的耐盐性突变体进行RFLP分析，表明RG4、RG711和R16三个位点有可能与耐盐性突变相关。Zhang et al（1995）[7]、郭岩等（1997）[8]和丁海媛等（1998）[9]将粳稻77-170的耐盐突变体M20的耐盐主效基因定位在第7染色体上。但这些研究未见有后续报道。
植物处在高盐环境下会产生两种效应;渗透效应和离子毒害。水稻在盐胁迫时的应答主要表现为：维护膜系统的稳定性、离子的区隔化、渗透调节和大分子蛋白的积累等(郭龙彪等，2010)[10]。离子调节主要是指通过调节细胞内外无机离子的相对浓度(主要是K+ 和Na+来调节细胞内膨压、细胞体积、胞内pH值和离子强度等许多重要的生理参数，从而维持细胞质内微环境的稳定。其整个生理过程表现：正常情况下大多数植物细胞内积累K+而将Na+排出胞外，使细胞内维持高K+/Na+，有利于K+行使Na+无法替代重要功能。因此，如果能找到调节水稻体内离子Na+、K+含量的基因，对水稻耐盐性分子机制的了解将产生很大的帮助。 本研究拟对一个水稻耐盐突变体st1进行生理及遗传特性分析。分析耐盐突变体st1与日本晴野生型在地上、地下部干重、鲜重、Ka+和Na+及Ka+/Na+的差异，探究st1的耐盐生理基础。
1. 材料与方法
1.1 材料
野生型水稻日本晴(Oryza sativa L. ssp. japonica var. *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
Nipponbare)；
从EMS诱变的日本晴突变体库中筛选到的一个水稻耐盐突变体st1；
日本晴水稻耐盐突变体st1与野生型日本晴杂交的F2群体216株。
1.2 耐盐性鉴定方法
1.2.1 材料培养
将水稻日本晴野生型以及耐盐突变体st1的种子在45℃烘箱内保存一周打破休眠，清水中浸泡3天，然后在32℃培养箱避光催芽24小时。选取萌发一致的种子将野生型与st1分区播种在去掉底部的96孔板上，自来水培养1周，然后换全营养液(参照国际水稻研究所配方)培养。
1.2.2 盐胁迫处理
当水稻培养至两叶一心时，开始进行盐胁迫处理。将st1突变体和日本晴野生型两叶一心期幼苗盐处理（120mM NaCl）后0、1、3、5、7、10d分别取样，并进行如下研究：测量地上部与根部鲜重和干重；分析地上部与根部Na+、K+等的含量。通过比较分析，明确st1突变体耐盐的生理基础。
1.2.3 生理测定方法
以六株一个重复的方式称取野生型及st1的地上部与地下部的鲜重，然后105℃杀青15min,并置于80℃烘箱内烘干直至恒重，再用同样的方式称取野生型及st1的地上部与地下部的干重。最后将以上样本用浓硝酸消煮2-3小时，，稀释到适宜浓度（100-200mg/L）采用电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）测定离子浓度。
1.3 遗传分析方法
利用突变体st1与其野生型日本晴杂交构建F2和F2;3群体，调查F2;3家系苗期耐盐性。具体方法为：每个家系播种16粒种子至去掉底部的96孔板，幼苗培养及盐胁迫处理同1.2.1和1.2.2；120mM NaCl 处理7天后取样，测定每个家系的地上部Na+含量。根据st1/日本晴F2群体地上部Na+含量分离情况判断st1是否为单基因突变，并确定相关基因的显隐性关系。
2.结果与分析
2.1 st1与野生型日本晴苗期耐盐性表型比较
[3].Flowers T J. Improving crop salt tolerance. J Exp Bot, 2004, 55 (396): 307-319
摘要：土壤盐渍化是制约世界农业发展的主要环境因子之一。因此，如何开发利用盐碱地，提高盐渍化土地上的作物产量，已成为一个紧迫而重大的研究课题。本实验以水稻日本晴经EMS诱变获得的耐盐突变体st1（salt tolerance 1）为试验材料，对盐胁迫下st1突变体的重要生理生化指标进行分析，包括：生物量、地上部与地下部的Na+、K+、含量等，发现st1突变体在盐胁迫下，相比日本晴野生型有着较高的K+/Na+和生物量。并通过st1与其野生型日本晴杂交，鉴定此耐盐基因的显隐性，确定耐盐性状是由单个隐性基因控制的。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
关键字:耐盐突变体；st1；生理鉴定；遗传分析。
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key word 3
引言 3
1. 材料与方法 4
1.1 材料 4
1.2 耐盐性鉴定方法 4
1.2.1 材料培养 4
1.2.2 盐胁迫处理 4
1.2.3 生理测定方法 4
1.3 遗传分析方法 5
2. 结果与分析 5
2.1 st1与野生型日本晴苗期耐盐性表型比较 5
2.2.盐胁迫对st1地上部与地下部鲜重含量的影响 6
2.3.盐胁迫对st1地上部与地下部Ka+、Na+及Ka+/Na+的影响 9
2.4.突变体st1的遗传分析 12
3. 讨论 13
3.1 st1耐盐性生理基础 13
3.2.st1突变体的遗传分析 13
致谢 13
参考文献 13
水稻耐盐突变体的生理鉴定与遗传分析
引言
土壤盐渍化是制约世界农业发展的主要环境因子之一。据联合国粮农组织（FAO）统计，全球有盐渍土超过8亿hm2，占总陆地面积的10%。全世界大约有20%的灌溉土地（0.45亿hm2）不同程度地遭到盐渍化的危害。而中国是盐渍土分布广泛的国家之一，各类盐渍土总面积约1亿hm2[1]，严重制约了我国农业生产的发展。因此，如何开发利用盐碱地，提高盐渍化土地上的作物产量，已成为一个紧迫而重大的研究课题。
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，总种植面积超过1.48亿hm2，是半数世界人口赖以生存的主要食物。由于水稻种植常常依赖于灌溉，而不合理的灌溉促使地下水中的盐分沿土壤 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
毛管孔隙上升并在地表积累，引起土壤次生盐渍化。因此，在水稻种植地区，盐渍化成为普遍的土壤问题，极大限制了水稻生产。严重情况下，盐污染几乎完全阻碍了大面积土地上水稻的生长。面对如此严峻的形势，在合理灌溉，预防土壤盐渍化加重的同时，有必要培育高度耐盐的优良水稻品种，以适应和改善当前不断恶化的土壤环境。
水稻耐盐性是受多基因控制的数量性状，遗传基础较为复杂。水稻属盐敏感作物，其耐盐遗传资源贫乏。国际水稻所筛选了全世界9万余份品（系），发现最耐盐的水稻品种（Pokkali）的耐盐性也不及普通小麦或大麦，且大多数野生稻的耐盐性也十分有限[2]（Akbar, 1986; Akbar et al, 1987）。近年来，有人提出通过诱导耐盐性水稻突变体的方法来解决这个问题[5][4]（Flowers, 2004; Flowers and Yeo, 1995)。一方面，良好的突变体材料是水稻耐盐性遗传改良的宝贵资源，可以直接为育种实践服务。另一方面，更重要的是，耐盐性或盐敏感性突变体可以为耐盐性相关基因的克隆以及功能分析提供重要材料，而耐盐性分子机理的不断揭示必然会进一步加速水稻耐盐新品种培育的进程。因此，诱导水稻耐盐性相关突变体材料，克隆耐盐性相关基因，对认识水稻的耐盐机理以及育种改良均具有重要意义。
水稻耐盐性属于数量性状遗传，受多基因控制[5](Lin et al., 2004)。虽然目前已经克隆了很多耐盐性相关基因，但要全面地理解植物适应盐胁迫的分子机制，目前所知道的还远远不够。突变体一直是水稻遗传和育种研究的重要材料，尤其是在水稻基因组测序工作完成之后，通过筛选鉴定突变体材料，进而分离克隆突变基因的研究方式，已成为世界上研究水稻基因功能的主要手段之一。
在水稻的耐盐性方面，国内早期的一些研究也曾尝试利用水稻突变体进行耐盐性相关基因的定位克隆工作。张耕耘等[6]（1994）对九个EMS诱变的耐盐性突变体进行RFLP分析，表明RG4、RG711和R16三个位点有可能与耐盐性突变相关。Zhang et al（1995）[7]、郭岩等（1997）[8]和丁海媛等（1998）[9]将粳稻77-170的耐盐突变体M20的耐盐主效基因定位在第7染色体上。但这些研究未见有后续报道。
植物处在高盐环境下会产生两种效应;渗透效应和离子毒害。水稻在盐胁迫时的应答主要表现为：维护膜系统的稳定性、离子的区隔化、渗透调节和大分子蛋白的积累等(郭龙彪等，2010)[10]。离子调节主要是指通过调节细胞内外无机离子的相对浓度(主要是K+ 和Na+来调节细胞内膨压、细胞体积、胞内pH值和离子强度等许多重要的生理参数，从而维持细胞质内微环境的稳定。其整个生理过程表现：正常情况下大多数植物细胞内积累K+而将Na+排出胞外，使细胞内维持高K+/Na+，有利于K+行使Na+无法替代重要功能。因此，如果能找到调节水稻体内离子Na+、K+含量的基因，对水稻耐盐性分子机制的了解将产生很大的帮助。 本研究拟对一个水稻耐盐突变体st1进行生理及遗传特性分析。分析耐盐突变体st1与日本晴野生型在地上、地下部干重、鲜重、Ka+和Na+及Ka+/Na+的差异，探究st1的耐盐生理基础。
1. 材料与方法
1.1 材料
野生型水稻日本晴(Oryza sativa L. ssp. japonica var. *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
Nipponbare)；
从EMS诱变的日本晴突变体库中筛选到的一个水稻耐盐突变体st1；
日本晴水稻耐盐突变体st1与野生型日本晴杂交的F2群体216株。
1.2 耐盐性鉴定方法
1.2.1 材料培养
将水稻日本晴野生型以及耐盐突变体st1的种子在45℃烘箱内保存一周打破休眠，清水中浸泡3天，然后在32℃培养箱避光催芽24小时。选取萌发一致的种子将野生型与st1分区播种在去掉底部的96孔板上，自来水培养1周，然后换全营养液(参照国际水稻研究所配方)培养。
1.2.2 盐胁迫处理
当水稻培养至两叶一心时，开始进行盐胁迫处理。将st1突变体和日本晴野生型两叶一心期幼苗盐处理（120mM NaCl）后0、1、3、5、7、10d分别取样，并进行如下研究：测量地上部与根部鲜重和干重；分析地上部与根部Na+、K+等的含量。通过比较分析，明确st1突变体耐盐的生理基础。
1.2.3 生理测定方法
以六株一个重复的方式称取野生型及st1的地上部与地下部的鲜重，然后105℃杀青15min,并置于80℃烘箱内烘干直至恒重，再用同样的方式称取野生型及st1的地上部与地下部的干重。最后将以上样本用浓硝酸消煮2-3小时，，稀释到适宜浓度（100-200mg/L）采用电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）测定离子浓度。
1.3 遗传分析方法
利用突变体st1与其野生型日本晴杂交构建F2和F2;3群体，调查F2;3家系苗期耐盐性。具体方法为：每个家系播种16粒种子至去掉底部的96孔板，幼苗培养及盐胁迫处理同1.2.1和1.2.2；120mM NaCl 处理7天后取样，测定每个家系的地上部Na+含量。根据st1/日本晴F2群体地上部Na+含量分离情况判断st1是否为单基因突变，并确定相关基因的显隐性关系。
2.结果与分析
2.1 st1与野生型日本晴苗期耐盐性表型比较
[3].Flowers T J. Improving crop salt tolerance. J Exp Bot, 2004, 55 (396): 307-319
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