CFP10ESAT6融合蛋白的原核表达及纯化
CFP10ESAT6融合蛋白的原核表达及纯化[20200614171930]
摘要：抗除草剂转基因作物和近缘种回交后代的适合度是评价转基因抗除草剂作物安全性的重要内容。本试验通过田间种植试验，研究了抗草甘膦转基因油菜（Brassica napus）和野芥菜(wild Brassica juncea )的正反回交1代子3代（BC1mF4R和BC1pF4R）和回交2代子2代（BC2mF3R和BC2pF3R）以及回交3代子1代（BC3mF2R和BC3pF2R）的适合度。结果表明，田间低密度（15株/区）种植条件下，在4:1（野芥菜：回交后代）混种比例下，各回交代的总适合度都显著低于野芥菜，但也具有较好的生长能力和较高结实率；在3:2和1:1混种比例下，回交3代子1代的总适合度与亲本野芥菜相当。田间高密度种植条件下，3个混种比例下，各回交后代的总适合度都显著低于野芥菜。在高密度下，携带抗草甘膦基因的各回交后代适合度虽不如野芥菜，但是从生长和繁殖能力来看，都能产生大量的种子。以上结果表明，携带抗性基因的回交后代在田间环境下有建立种群的可能性，因此其可能引起的生态风险不容忽视。
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关键字:抗草甘膦转基因油菜；野芥菜；回交后代；田间适合度
目录
摘要 2
关键词 2
Abstract 2
Key words 3
引言 3
1 材料与方法 4
1.1 材料 4
1.2 方法 4
1.2.1田间试验设计.4
2.田间试验移栽密度与比例设计 5
2.1适合度成份指标和测定方法 5
2.1.1营养生长指标及测定方法 5
2.1.2生殖生长指标及测定方法 5
3.1低密度下各回交后代与野芥菜的比较 5
3.1.1低密度下各回交后代营养指标比较 ..5
3.1.2低密度下各回交后代生殖指标比较..7
3.2高密度下各回交后代与野芥菜的比较 9
3.2.1高密度下各回交后代营养指标比较.9
3.2.2高密度下各回交后代生殖指标比较11
4.讨论 13
5.致谢 15
参考文献： 16
抗草甘膦转基因油菜和野芥菜BC1F4、BC2F3、BC3F2的田间适合度研究
引言
Student majoring in biotechnology Name Sunqiancheng
Tutor Songxiaoling
Key words: Glyphosate-resistant oilseed rape ;wild B. juncea ;backcross generation;fitness.
引言
抗除草剂转基因油菜（Brassica napus）是转基因作物中开发早、推广应用面积最大的作物之一（卢长明，2005） *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
。由于油菜能产生大量的花粉，在田间可通过相邻植株的接触或风和昆虫等传播媒介进行异花授粉（蔡丽等，2008），同时在自然环境中存在许多野生近缘种，因此转基因油菜的安全性倍受人们关注，其中最为重要的是转基因油菜的抗性基因漂移到野生近缘杂草中，给生态环境带来难以估量的损失（Mikkelsen et al., 1996; Chapman et al., 2006; FitzJohn et al., 2007; Warwick et al., 2008）。
我国目前尚没有转基因油菜的商品化，但平均每年从抗草甘膦转基因油菜种植的最大国加拿大进口油菜籽 100 多万吨（最多时达 300 万吨），其中60%以上是转基因油菜，这些油菜籽在运输的过程中可能通过种子的洒落而逃逸（卢长明等，2005）。转基因油菜通过种子逃逸已经得到证实（Yoshimura et al., 2006; Aono et al., 2006; Kawata et al., 2009）。加上我国油菜的转基因研究相当活跃，有的已进入环境释放和生产性试验阶段（官春云，2005；孟亚雄等，2007；杜建中等，2008；刘丹等，2008），因此在我国开展抗除草剂转基因油菜的环境安全性评估必不可少（浦惠明，2003；卢长明，2005）。
在我国，和甘蓝型油菜（B. napus）亲缘关系较近的野生杂草中最重要的是野芥菜wild B,juncea。野芥菜是芥菜型栽培油菜自逸的产物，特别值得关注的是野芥菜部分种群已对我国广泛使用的灭生性除草剂草甘膦具有一定抗性(Huangfu et al., 2007)，而且甘蓝型油菜和芥菜有一个共同的基因组，增加了种间杂交和基因漂移的可能性。因此如果抗草甘膦转基因油菜的抗性基因能成功漂移到野芥菜中，将会对我国生态环境产生很大的负面影响。
抗性基因能否成功地漂移野生近缘种取决于两个方面(Darmency et al., 2000; Chèvre et al., 2007)，一是抗性作物和野生近缘种的亲和性，这是决定抗性基因能否漂移到野生近缘种的首要条件，二是杂交和回交代的适合度（fitness）。适合度是个体在特定环境条件下的生存和繁殖能力，它决定杂交或回交代能否在自然界中生存定居，并建立种群(Jenczewski et al., 2003)。转基因能否成功渗入（introgression）到野生近缘种中很大程度上依赖杂交和回交代的适合度，如果杂交或回交代能在自然界中建立种群，将会产生很大的生态危机。许多研究表明在田间自然条件下抗性油菜和芥菜能自发杂交（J?rgensen et al., 1998; Bing et al., 1996; Frello et al., 1995）。
目前携带抗性基因的野生近缘种能否在自然界中生存定植没有明确的定论。现有研究结果表明，芸薹属植物和不同近缘种的杂交或回交代的适合度表现不全一致。Darmency et al.（2000）的研究表明甘蓝型油菜和灰芥(Hirschfeldia incana )回交代的结实量随着回交代数的增加而下降，在回交4代中没有种子成苗；然而甘蓝型油菜和野萝卜（Raphanus raphanistrum）回交的结实量随着回交代数的增加而不断增加，部分杂种能存活并产生种子，增加了基因逃逸的可能性 (Chévre et al., 1997)。Guè *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
ritaine et al. (2002) 研究了转基因油菜和野萝卜的异细胞质回交6代的适合度，表明油菜细胞质后代的适合度比野萝卜细胞质回交6代的适合度低100倍。Hauser et al.（2003）研究了转基因油菜和芜菁（B. rapa）的杂交和回交后代在不同种植数量和密度下的适合度，表明后代的适合度与种植数量及密度密切相关。Campbell 和Snow (2007)研究了油菜和野萝卜杂交后代的适合度，表明竞争条件下由于减少了野萝卜和杂交后代生殖适合度的差异而增加了杂交后代的适合度。
携带抗性基因的野生近缘种的适合度依赖许多因素，包括研究的物种、父母本的基因型，抗性基因本身和测试的环境条件等。虽然许多学者认为抗除草剂基因在除草剂选择压下才有可能在田间持续下去，但Warwick et al. (2008)的研究证实携带抗性基因的油菜和近缘种芜菁的杂交或回交后代即使在无除草剂选择压的田间环境条件下也能持续生存6年。这个结果说明在真实的农田环境下进行安全性评估的重要性。Campbell and Snow (2009) 认为深入了解作物和野生近缘种的杂交后代在不同生态环境条件下的适应性，有助于从深层次开展转基因作物释放给环境造成的潜在危害。
我们实验室以抗草甘膦转基因油菜（DS-Roughrider，Roundup Ready，event RT73）为父本，以南京江浦采集的野芥菜为母本，人工杂交获得了携带抗草甘膦基因的F1，但F1几乎不能结实（宋小玲等，2007）。分别以携带抗性基因的F1或回交代为父母本与野芥菜进行回交，发现第1次和第2次回交中，以野芥菜为母本的回交代（正向回交）结实率明显高于以其为父本的回交代（反向回交）结实率，当以携带抗性基因的BC2F1或BC3F1和野芥菜进行第3次和第4次回交时，正反回交组合以及获得的BC2F1和BC3F1的自交结实率都和野芥菜无明显差异。但以往的研究都是在温室条件下进行的研究，尚未对回交代的田间生存能力开展研究。
表1田间试验种植密度和比例
比例（野芥菜： 回交后代） 回交后代 15株/区（20株/区） 30株/区
摘要：抗除草剂转基因作物和近缘种回交后代的适合度是评价转基因抗除草剂作物安全性的重要内容。本试验通过田间种植试验，研究了抗草甘膦转基因油菜（Brassica napus）和野芥菜(wild Brassica juncea )的正反回交1代子3代（BC1mF4R和BC1pF4R）和回交2代子2代（BC2mF3R和BC2pF3R）以及回交3代子1代（BC3mF2R和BC3pF2R）的适合度。结果表明，田间低密度（15株/区）种植条件下，在4:1（野芥菜：回交后代）混种比例下，各回交代的总适合度都显著低于野芥菜，但也具有较好的生长能力和较高结实率；在3:2和1:1混种比例下，回交3代子1代的总适合度与亲本野芥菜相当。田间高密度种植条件下，3个混种比例下，各回交后代的总适合度都显著低于野芥菜。在高密度下，携带抗草甘膦基因的各回交后代适合度虽不如野芥菜，但是从生长和繁殖能力来看，都能产生大量的种子。以上结果表明，携带抗性基因的回交后代在田间环境下有建立种群的可能性，因此其可能引起的生态风险不容忽视。
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关键字:抗草甘膦转基因油菜；野芥菜；回交后代；田间适合度
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摘要 2
关键词 2
Abstract 2
Key words 3
引言 3
1 材料与方法 4
1.1 材料 4
1.2 方法 4
1.2.1田间试验设计.4
2.田间试验移栽密度与比例设计 5
2.1适合度成份指标和测定方法 5
2.1.1营养生长指标及测定方法 5
2.1.2生殖生长指标及测定方法 5
3.1低密度下各回交后代与野芥菜的比较 5
3.1.1低密度下各回交后代营养指标比较 ..5
3.1.2低密度下各回交后代生殖指标比较..7
3.2高密度下各回交后代与野芥菜的比较 9
3.2.1高密度下各回交后代营养指标比较.9
3.2.2高密度下各回交后代生殖指标比较11
4.讨论 13
5.致谢 15
参考文献： 16
抗草甘膦转基因油菜和野芥菜BC1F4、BC2F3、BC3F2的田间适合度研究
引言
Student majoring in biotechnology Name Sunqiancheng
Tutor Songxiaoling
Key words: Glyphosate-resistant oilseed rape ;wild B. juncea ;backcross generation;fitness.
引言
抗除草剂转基因油菜（Brassica napus）是转基因作物中开发早、推广应用面积最大的作物之一（卢长明，2005） *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
。由于油菜能产生大量的花粉，在田间可通过相邻植株的接触或风和昆虫等传播媒介进行异花授粉（蔡丽等，2008），同时在自然环境中存在许多野生近缘种，因此转基因油菜的安全性倍受人们关注，其中最为重要的是转基因油菜的抗性基因漂移到野生近缘杂草中，给生态环境带来难以估量的损失（Mikkelsen et al., 1996; Chapman et al., 2006; FitzJohn et al., 2007; Warwick et al., 2008）。
我国目前尚没有转基因油菜的商品化，但平均每年从抗草甘膦转基因油菜种植的最大国加拿大进口油菜籽 100 多万吨（最多时达 300 万吨），其中60%以上是转基因油菜，这些油菜籽在运输的过程中可能通过种子的洒落而逃逸（卢长明等，2005）。转基因油菜通过种子逃逸已经得到证实（Yoshimura et al., 2006; Aono et al., 2006; Kawata et al., 2009）。加上我国油菜的转基因研究相当活跃，有的已进入环境释放和生产性试验阶段（官春云，2005；孟亚雄等，2007；杜建中等，2008；刘丹等，2008），因此在我国开展抗除草剂转基因油菜的环境安全性评估必不可少（浦惠明，2003；卢长明，2005）。
在我国，和甘蓝型油菜（B. napus）亲缘关系较近的野生杂草中最重要的是野芥菜wild B,juncea。野芥菜是芥菜型栽培油菜自逸的产物，特别值得关注的是野芥菜部分种群已对我国广泛使用的灭生性除草剂草甘膦具有一定抗性(Huangfu et al., 2007)，而且甘蓝型油菜和芥菜有一个共同的基因组，增加了种间杂交和基因漂移的可能性。因此如果抗草甘膦转基因油菜的抗性基因能成功漂移到野芥菜中，将会对我国生态环境产生很大的负面影响。
抗性基因能否成功地漂移野生近缘种取决于两个方面(Darmency et al., 2000; Chèvre et al., 2007)，一是抗性作物和野生近缘种的亲和性，这是决定抗性基因能否漂移到野生近缘种的首要条件，二是杂交和回交代的适合度（fitness）。适合度是个体在特定环境条件下的生存和繁殖能力，它决定杂交或回交代能否在自然界中生存定居，并建立种群(Jenczewski et al., 2003)。转基因能否成功渗入（introgression）到野生近缘种中很大程度上依赖杂交和回交代的适合度，如果杂交或回交代能在自然界中建立种群，将会产生很大的生态危机。许多研究表明在田间自然条件下抗性油菜和芥菜能自发杂交（J?rgensen et al., 1998; Bing et al., 1996; Frello et al., 1995）。
目前携带抗性基因的野生近缘种能否在自然界中生存定植没有明确的定论。现有研究结果表明，芸薹属植物和不同近缘种的杂交或回交代的适合度表现不全一致。Darmency et al.（2000）的研究表明甘蓝型油菜和灰芥(Hirschfeldia incana )回交代的结实量随着回交代数的增加而下降，在回交4代中没有种子成苗；然而甘蓝型油菜和野萝卜（Raphanus raphanistrum）回交的结实量随着回交代数的增加而不断增加，部分杂种能存活并产生种子，增加了基因逃逸的可能性 (Chévre et al., 1997)。Guè *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
ritaine et al. (2002) 研究了转基因油菜和野萝卜的异细胞质回交6代的适合度，表明油菜细胞质后代的适合度比野萝卜细胞质回交6代的适合度低100倍。Hauser et al.（2003）研究了转基因油菜和芜菁（B. rapa）的杂交和回交后代在不同种植数量和密度下的适合度，表明后代的适合度与种植数量及密度密切相关。Campbell 和Snow (2007)研究了油菜和野萝卜杂交后代的适合度，表明竞争条件下由于减少了野萝卜和杂交后代生殖适合度的差异而增加了杂交后代的适合度。
携带抗性基因的野生近缘种的适合度依赖许多因素，包括研究的物种、父母本的基因型，抗性基因本身和测试的环境条件等。虽然许多学者认为抗除草剂基因在除草剂选择压下才有可能在田间持续下去，但Warwick et al. (2008)的研究证实携带抗性基因的油菜和近缘种芜菁的杂交或回交后代即使在无除草剂选择压的田间环境条件下也能持续生存6年。这个结果说明在真实的农田环境下进行安全性评估的重要性。Campbell and Snow (2009) 认为深入了解作物和野生近缘种的杂交后代在不同生态环境条件下的适应性，有助于从深层次开展转基因作物释放给环境造成的潜在危害。
我们实验室以抗草甘膦转基因油菜（DS-Roughrider，Roundup Ready，event RT73）为父本，以南京江浦采集的野芥菜为母本，人工杂交获得了携带抗草甘膦基因的F1，但F1几乎不能结实（宋小玲等，2007）。分别以携带抗性基因的F1或回交代为父母本与野芥菜进行回交，发现第1次和第2次回交中，以野芥菜为母本的回交代（正向回交）结实率明显高于以其为父本的回交代（反向回交）结实率，当以携带抗性基因的BC2F1或BC3F1和野芥菜进行第3次和第4次回交时，正反回交组合以及获得的BC2F1和BC3F1的自交结实率都和野芥菜无明显差异。但以往的研究都是在温室条件下进行的研究，尚未对回交代的田间生存能力开展研究。
表1田间试验种植密度和比例
比例（野芥菜： 回交后代） 回交后代 15株/区（20株/区） 30株/区
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