水稻逆境响应sr基因功能初步分析
可变剪接是调节基因表达与产生蛋白质组多样性的一个重要机制，是导致真核生物基因和蛋白质数量产生较大差异的重要原因。SR蛋白作为一种剪接因子，在可变剪接中发挥着重要作用。水稻是重要的粮食作物，以水稻为背景分析可变剪接相关机理对于研究水稻逆境胁迫下的生理变化和分子机制有重要帮助。本文以水稻SR基因OsSCL57为研究对象，研究该基因的突变体在逆境胁迫下的生理变化，发现OsSCL57的敲除可能会减弱水稻的抗逆能力，尤其是水稻的耐高温和耐盐能力会受到显著的影响。此外，利用Gateway技术构建了OsSCL57转基因载体，通过农杆菌介导的遗传转化得到了OsSCL57过表达的转基因植株，为该基因功能的进一步研究提供了帮助。
目录
摘要1
关键词1
Abstract 1
Key words 1
引言1
1 材料与方法 2
1.1 试验材料及试剂 3
1.2 水稻培养 3
1.3 胁迫处理 3
1.4 叶片DNA的提取 3
1.5 PCR检测 3
1.6 转基因载体的构建 3
1.7 水稻的遗传转化 4
2 结果与分析 5
2.1 OsSCL57基因突变体鉴定 5
2.2 突变体胁迫实验 6
2.2.1 突变体表型测定 6
2.2.2 胁迫处理下突变体地上、地下部生长长度测定 6
2.3 OsSCL57基因过表达载体的构建与水稻的遗传转化 8
2.3.1 过表达载体的构建 8
2.3.2 转基因植株的培育8
2.3.3 转基因植株DNA鉴定 9
3 讨论 9
致谢 10
参考文献 11 水稻逆境响应SR基因功能初步分析
生命科学与技术基地班 王谨
引言
RNA剪接在真核细胞基因表达过程非常重要，通过RNA剪接，可以产生许多具有功能的mRNA，对生物的发育及进化至关重要。有些基因的一个mRNA前体通过不同的剪接方式 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
产生不同mRNA剪接异构体，这一过程即称为可变剪接（AS）。可变剪接在植物体内广泛发生，为植物体内转录组与蛋白质组多样性提供了大量的资源[1]。在植物体内，可变剪接大多都发生在植物发育的早期，其主要机制有四种：外显子跳跃、内含子保留、供体位点与受体位点的可选择性[2]。AS在很多植物生理过程中都发挥着重要的作用，但是其相关机制还需要进一步研究。
PremRNA通过剪接复合体完成RNA剪接过程。剪接复合体包含了核小RNA蛋白质复合体(snRNP)与其他多种蛋白质因子。大约有145种蛋白质因子与mRNA前体的剪接相关。这其中包括富含精氨酸和丝氨酸蛋白(Arginine/serinerich proteins,SR蛋白)和参与组成hnRNP的蛋白质、RNA解旋酶和激酶等[3]。几乎每种含有内含子的基因都会产生多种剪接异构体，许多剪接事件也会受到细胞、组织等不同水平的调控[4]。
参与RNA剪接的因子有SR蛋白、hnRNP形成因子以及RNA解旋酶类剪接因子等，其中，SR家族蛋白是一类RNA结合蛋白，作为一种基本的因子在剪接过程中发挥着重要的作用。Andrea Barta等[5]在拟南芥及水稻中鉴定出6种SR亚家族成员，其中3种为植物所特有，其特点为具有1个或2个N末端RNA识别区（RRMs），下游RS结构域具有至少50个氨基酸。SR家族蛋白在剪接复合体的聚集形成以及剪接因子在mRNA前体链上结合位点的识别过程中起着关键作用[3]，RRM区域参与了premRNA剪切位点的选择，RS结构域介导了了蛋白之间的相互作用，同时也充当了剪切激活物[6]。SR的N端与RNA结合，C端富含丝氨酸一精氨酸残基的RS结构域能与同样含有RS结构域的U2AF和U1hnRNP发生相互作用，从而在剪接复合体和剪接位点相互识别的过程中起到桥的作用。不同的SR蛋白具有不同的效应，一些会抑制剪接的发生，一些会促进RNA的剪接过程。在拟南芥中，14种SR基因经过可变剪接后可形成约100种不同的变体，在植物的不同组织、受到不同胁迫的条件下，SR的剪接方式也会有所不同[2]。以SR45为例，其自身经过可变剪接作用后形成SR45.1和SR45.2 2种转录本[7]，对植物体中其他SR基因premRNA的可变剪接具有调控作用，Day等[7]通过酵母双杂交分析得到SR45能与U2AF35相互作用，其中SR45的RS1、RS2结构域各自独立的与U2AF35结合，调控SR30的剪接过程。
OsSCL57属于水稻SR基因家族成员，本次研究发现通过TDNA插入法敲除该基因后，水稻对于低温、高温及盐害的抗性减弱，尤其对高温和盐害更加敏感。因此初步得出OsSCL57基因可能参与了水稻对逆境的响应过程；此外，研究中还通过Gateway方法构建得到OsSCL57基因表达载体，结合转基因技术，得到该基因的过表达植株，从而为进一步研究OsSCL57基因功能，提出增强水稻抗逆能力的新思路提供了帮助。
1 材料与方法
1.1 试验材料及试剂
本实验所用水稻材料均以DongJing为遗传背景。OsSCL57基因TDNA插入突变体PFG_1A20202和PFG_1A11441种子均从水稻突变体库购得。
1.2 水稻培养
选取完好的DongJing、PFG_1A20202和PFG_1A11441种子，去离子水浸种，待种子露白后，挑选长势一致的种子5mM CaCl2培养4天，随后更换1/2木村培养液，苗龄2周时取样以进行PCR检测，同时挑选长势一致的水稻幼苗用于表型实验。
1.3 胁迫处理
对苗龄2周的水稻进行高温、低温和NaCl处理，每种处理设置3个重复，每种处理时间为2天，处理后将水稻移至温室中恢复1周，并对恢复后的植株进行形态指标测定。高温处理温度设定为43℃，低温4℃，NaCL处理浓度为100mM和150mM，另外设置无处理的对照组。
1.4 叶片DNA的提取
DNA提取步骤如下：在2ml离心管中加入钢珠，机器研磨65HZ 100s，短暂离心后加入650μL TPS充分裂解，在65℃下水浴半小时。13200r离心10min，取500μL上清于500μL异丙醇中，充分混匀，使DNA沉淀，13200r再次离心10min。弃上清，加入800μL 70％乙醇洗涤沉淀，去除乙醇后彻底晾干，加入50μL无菌水溶解。
目录
摘要1
关键词1
Abstract 1
Key words 1
引言1
1 材料与方法 2
1.1 试验材料及试剂 3
1.2 水稻培养 3
1.3 胁迫处理 3
1.4 叶片DNA的提取 3
1.5 PCR检测 3
1.6 转基因载体的构建 3
1.7 水稻的遗传转化 4
2 结果与分析 5
2.1 OsSCL57基因突变体鉴定 5
2.2 突变体胁迫实验 6
2.2.1 突变体表型测定 6
2.2.2 胁迫处理下突变体地上、地下部生长长度测定 6
2.3 OsSCL57基因过表达载体的构建与水稻的遗传转化 8
2.3.1 过表达载体的构建 8
2.3.2 转基因植株的培育8
2.3.3 转基因植株DNA鉴定 9
3 讨论 9
致谢 10
参考文献 11 水稻逆境响应SR基因功能初步分析
生命科学与技术基地班 王谨
引言
RNA剪接在真核细胞基因表达过程非常重要，通过RNA剪接，可以产生许多具有功能的mRNA，对生物的发育及进化至关重要。有些基因的一个mRNA前体通过不同的剪接方式 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
产生不同mRNA剪接异构体，这一过程即称为可变剪接（AS）。可变剪接在植物体内广泛发生，为植物体内转录组与蛋白质组多样性提供了大量的资源[1]。在植物体内，可变剪接大多都发生在植物发育的早期，其主要机制有四种：外显子跳跃、内含子保留、供体位点与受体位点的可选择性[2]。AS在很多植物生理过程中都发挥着重要的作用，但是其相关机制还需要进一步研究。
PremRNA通过剪接复合体完成RNA剪接过程。剪接复合体包含了核小RNA蛋白质复合体(snRNP)与其他多种蛋白质因子。大约有145种蛋白质因子与mRNA前体的剪接相关。这其中包括富含精氨酸和丝氨酸蛋白(Arginine/serinerich proteins,SR蛋白)和参与组成hnRNP的蛋白质、RNA解旋酶和激酶等[3]。几乎每种含有内含子的基因都会产生多种剪接异构体，许多剪接事件也会受到细胞、组织等不同水平的调控[4]。
参与RNA剪接的因子有SR蛋白、hnRNP形成因子以及RNA解旋酶类剪接因子等，其中，SR家族蛋白是一类RNA结合蛋白，作为一种基本的因子在剪接过程中发挥着重要的作用。Andrea Barta等[5]在拟南芥及水稻中鉴定出6种SR亚家族成员，其中3种为植物所特有，其特点为具有1个或2个N末端RNA识别区（RRMs），下游RS结构域具有至少50个氨基酸。SR家族蛋白在剪接复合体的聚集形成以及剪接因子在mRNA前体链上结合位点的识别过程中起着关键作用[3]，RRM区域参与了premRNA剪切位点的选择，RS结构域介导了了蛋白之间的相互作用，同时也充当了剪切激活物[6]。SR的N端与RNA结合，C端富含丝氨酸一精氨酸残基的RS结构域能与同样含有RS结构域的U2AF和U1hnRNP发生相互作用，从而在剪接复合体和剪接位点相互识别的过程中起到桥的作用。不同的SR蛋白具有不同的效应，一些会抑制剪接的发生，一些会促进RNA的剪接过程。在拟南芥中，14种SR基因经过可变剪接后可形成约100种不同的变体，在植物的不同组织、受到不同胁迫的条件下，SR的剪接方式也会有所不同[2]。以SR45为例，其自身经过可变剪接作用后形成SR45.1和SR45.2 2种转录本[7]，对植物体中其他SR基因premRNA的可变剪接具有调控作用，Day等[7]通过酵母双杂交分析得到SR45能与U2AF35相互作用，其中SR45的RS1、RS2结构域各自独立的与U2AF35结合，调控SR30的剪接过程。
OsSCL57属于水稻SR基因家族成员，本次研究发现通过TDNA插入法敲除该基因后，水稻对于低温、高温及盐害的抗性减弱，尤其对高温和盐害更加敏感。因此初步得出OsSCL57基因可能参与了水稻对逆境的响应过程；此外，研究中还通过Gateway方法构建得到OsSCL57基因表达载体，结合转基因技术，得到该基因的过表达植株，从而为进一步研究OsSCL57基因功能，提出增强水稻抗逆能力的新思路提供了帮助。
1 材料与方法
1.1 试验材料及试剂
本实验所用水稻材料均以DongJing为遗传背景。OsSCL57基因TDNA插入突变体PFG_1A20202和PFG_1A11441种子均从水稻突变体库购得。
1.2 水稻培养
选取完好的DongJing、PFG_1A20202和PFG_1A11441种子，去离子水浸种，待种子露白后，挑选长势一致的种子5mM CaCl2培养4天，随后更换1/2木村培养液，苗龄2周时取样以进行PCR检测，同时挑选长势一致的水稻幼苗用于表型实验。
1.3 胁迫处理
对苗龄2周的水稻进行高温、低温和NaCl处理，每种处理设置3个重复，每种处理时间为2天，处理后将水稻移至温室中恢复1周，并对恢复后的植株进行形态指标测定。高温处理温度设定为43℃，低温4℃，NaCL处理浓度为100mM和150mM，另外设置无处理的对照组。
1.4 叶片DNA的提取
DNA提取步骤如下：在2ml离心管中加入钢珠，机器研磨65HZ 100s，短暂离心后加入650μL TPS充分裂解，在65℃下水浴半小时。13200r离心10min，取500μL上清于500μL异丙醇中，充分混匀，使DNA沉淀，13200r再次离心10min。弃上清，加入800μL 70％乙醇洗涤沉淀，去除乙醇后彻底晾干，加入50μL无菌水溶解。
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