耐重金属苜蓿根瘤菌的分离筛选及其生物学特性
摘 要：根瘤菌-豆科植物共生固氮体系不仅能促进植物的生长，更能够减少化肥的使用，提高农产品的品质，还可以在一定程度上改良土壤结构，修复土壤资源。本研究首先从苜蓿的根瘤中分离出多株根瘤菌，通过研究其抗重金属能力以及产IAA和铁载体的能力，并进行简单的生物学特性的研究，筛选出性状较为优良的菌株。结果表明，根瘤菌17，19，33三株菌对于铜、镉两种重金属均有一定的耐受性。同时，根瘤菌17菌株对于盐的耐受能力较好。在耐酸碱性实验中，三株菌均能在pH为6~9的弱酸性、中性、弱碱性环境中生长。根瘤菌17，19，33菌株在pH为11时仍能生长，说明三株菌对碱性环境耐受能力较好。三株菌的淀粉水解实验反应为阴性、过氧化氢酶实验结果为阳性、硝酸盐还原能力为阳性、BTB反应为碱性。研究结果可以为后续的植物-微生物联合修复重金属污染土壤的研究提供一定的依据和最佳的材料选择。关键字：根瘤菌；重金属抗性；生物学特性The isolation and biological characteristics of the heavy metal resistance rhizobia from alfalfaStudent majoring in biology Zhang Min Tutor He LinyanAbstract: The symbiotic nitrogen-fixing system of rhizobia and legumes can not only?promote the growth of plants, but also?can?reduce?the use of chemical fertilizer and improve the quality of agricultural products. Besides these, it also can improve soil structure effectively and repair soil resource. In this study we isolated a variety of rhizobia from?alfalfa?root nodule firstly. To?select a series of rhizobia with excelle
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
nt characteristics, we analyzed resistance to heavy metal of these strains and their abilities of releasing IAA and icon carriers. Besides these, we also did some research about their biological characteristics. The results showed that strains 17, 19, 33 had the resistance to heavy metal of Cu and Cd. In the salt tolerance experiment, strain 17 had high tolerance to salt. In the acid and alkali resistance experiments, results showed that the strains can grow in the slightly acid, neutral and slightly alkaline condition. They can grow on the pH value of 6~9. When the pH value up to 11, strains 17, 19, 33 can still grow in the culture, which means these strains had certain tolerance on alkali. The three strains showed feminine gender in the amylum hydrolysis test and masculine gender in the catalase test and nitrate reduction test. In the BTB test, all of the results showed alkali. The results of this study can provide a basis and?the best?choice of material for the further?research of using plants combined with microorganism to restore the soil which was polluted by heavy metal. Key Words: rhizobia; the resistance to heavy metal; physiological and biochemical characteristics近年来，随着工农业的发展、人类活动的增加，产生了大量的污染物。这些污染物进入土壤并逐渐积累，导致土壤受到严重污染。其中一种主要污染是重金属污染。由于重金属污染物具有在土壤中移动性小，不易随水淋滤，不被微生物降解的特点，重金属可能会通过食物链进入人体引起慢性中毒[1~2]。因此，如何修复重金属污染土壤已成为生态保护的热点问题。在重金属污染地，重金属毒性和养分不足是重金属污染地植被恢复的主要限制因子，而氮素的极端不足又是养分不足的核心问题[3~4]，因此提高重金属污染地氮素含量水平成为重金属污染地生态修复的首要工作。生物固氮作为一种在自然生态系统中氮的来源的主要方式十分具有研究意义。在生物固氮中，豆科植物-根瘤菌固氮体系每年的固氮量可以达到全球生物固氮量的65% 以上，是一种十分重要的固氮方式[5~6]。同时，根瘤菌与豆科植物的共生固氮体系具有成本低廉、不污染环境的特点。另外，该体系还可以起到改良土壤结构，增加土壤肥力的作用[7~8]。所以，探讨如何提高该体系下的固氮能力对于修复重金属污染土壤，维持生态环境有着重要意义。因而豆科植物与根瘤菌的共生固氮作用是近年来研究的热点问题[9]。 根瘤菌是一类能促使植物异常增生的革兰氏染色为阴性的需氧杆菌。通常以鞭毛运动，没有芽孢。能够利用多种碳水化合物。根瘤菌能够与豆科植物共生，形成根瘤并能够通过固定空气中的氮气为植物提供营养。根瘤菌在根瘤组织中存在有三种主要的形态：(1)在幼小的根瘤中，是很小的有鞭毛能运动的短杆菌;(2)在根瘤发育的过程中，菌体逐渐变大，无鞭毛，呈现环节状，依然能运动的短杆菌，有些种会一端膨大或是分支成不同的形态，处于这种形态阶段的根瘤菌称类菌体;(3)随着根瘤衰败，类菌体崩裂，变成很小的球状和短杆状细菌[10]。根瘤菌与豆科植物的共生体系在许多重金属污染的废弃地依然有着较为良好的长势，说明根瘤菌的生命力比较旺盛，对于环境的适应能力较为显著[11~13]。多项研究结果表明，许多根瘤菌对于不同的重金属均有一定的抗性[14~15]。根瘤菌对重金属离子抗性较高的原因可能有以下几个方面：(1)根瘤菌可以使细胞外层屏障降低对重金属离子的通透性，其细胞外层的相关屏障包括脂多糖等，可以与重金属离子形成复合物，从而使金属离子对细胞的毒害性大大降低;(2)细胞的外排作用，避免毒素在细胞内的积累[8、16]。根瘤菌对于重金属的耐性在一定程度上保证了豆科植物的生长情况，使其避免受到重金属土壤的伤害，并促进豆科植物的生长。此外，前人对于豆科植物在生态恢复等方面的应用也进行了相关的概述，提出豆科植物不仅抗逆性较强，同时具有生长范围广的优点[17]。而且也有人提出豆科植物对于重金属离子耐受性的原因可能包括：豆科植物可以通过外植体途径和共质体途径来抵抗重金属离子对于植物的伤害[8]。由此可见，豆科植物和根瘤菌对于重金属离子都有一定的抗性，两者相互结合的修复方式也有一定的优点，如：修复效果好，无污染，提高修复效率，可以克服单一修复方式的局限性[18]。但是，由于存在“同一种植物在不同生态环境中可与不同根瘤菌结瘤固氮，而在生态地理环境相近的地区中，同一根瘤菌可与多种豆科植物共生”的现象[19]。也就是说，根瘤菌-豆科植物的结合受到环境等其他因素的影响较大[6]。因此，我们在利用根瘤菌-豆科植物的共生体系时需要针对具体的根瘤菌以及宿主植物在特定的环境下进行研究。此外，有研究发现，很多时候根瘤菌对于植物的促生作用并不十分明显。究其原因，根瘤菌本身的抗逆性可能是原因之一。但是，还有可能是因为根瘤菌与豆科植物的特异性作用有关[20~21]。因此，为了能够使根瘤菌与豆科植物的共生固氮体系取得较为良好的效果，从而为该体系修复重金属污染土壤的研究提供一定的依据。本研究从耐重金属的苜蓿根瘤中分离菌株出发，筛选得到抗重金属、耐盐性、耐碱性等抗逆性良好的菌株。并且探索这些菌株是否有其他相对优良的理化性质，以便于为后续构建良好的根瘤菌-豆科植物共生体系、研究该共生体系在重金属污染条件下的生长状况，及修复重金属污染土壤的能力提供一定的依据和材料。1. 实验材料与方法1.1 实验仪器电子天平、高压灭菌锅、恒温摇床、恒温培养箱、微量移液器、分光光度计 1.2 实验材料和试剂1.2.1菌株三株根瘤菌（菌株编号17，19，33），实验室保存，分离自重金属污染土壤中生长的苜蓿根瘤。1.2.2培养基和试剂1.2.2.1 培养基YMA固体培养基：甘露醇10.0?g，K2HPO4?0.5?g，酵母粉1.0?g，谷氨酸钠0.5 g，NaCl 0.05 g，solution A(MgSO4·7H2O 1.0 g，distilled water 100 mL)10 mL，solution B(CaCl2·2H2O?5.28 g，distilled water 100 mL)1 mL，solution C(FeCl3·6H2O 666 mg，distilled water 100 mL)1 mL，固体琼脂2% ；YN液体培养基：蔗糖10.0 g，(NH4)2SO4 1.0 g，K2HPO4 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.1 g，酵母粉0.5 g；TY液体培养基：胰蛋白胨5.0?g，酵母粉3.0?g，无水CaCl2?0.647?g，pH?7.0～7.2；?Fahraeus无氮营养液：Na2HPO4·2H2O?0.15?g，CaCl2·2H2O?0.10?g，MgSO4·7H2O?0.12?g，KH2PO4?0.10?g，柠檬酸铁0.005?g；?微量元素液：H3BO4?2.86?g，MnSO4·4H2O?2.03 g，Na2Mo4·7H2O?0.08 g，ZnSO4·7H2O?0.22?g，CuSO4·5H2O?0.08?g（使用时取1 mL加入1 L?Fahraeus无氮营养液中）；淀粉培养基：胰蛋白胨10.0 g，牛肉膏5.0 g，NaCl 5.0 g， 淀粉2.0 g，pH?7.0～7.2；硝酸盐培养基：胰蛋白胨5.0 g，KNO3 0.2 g；葡萄糖培养基：胰蛋白胨5.0 g，葡萄糖5.0 g，K2HPO4 0.5 g，pH?7.0～7.2；以上培养基、营养液除特殊说明外，配制时均用蒸馏水定容至1000?mL，在121℃灭菌25?min。1.2.2.2试剂草酸铵结晶紫染液：溶液A：结晶紫2.0 g，95% 酒精20 mL。溶液B：草酸铵0.8 g，蒸馏水95 mL；碘液：碘片1.0 g，碘化钾2.0 g，蒸馏水300 mL；番红：番红2.5% 的酒精溶液20 mL，蒸馏水80 mL；Cu2+，Cd2+母液均为10 g/L，过滤除菌后使用；10*TE buffer：100 mM Tris·HCl，10 mM EDTA 1 L；色氨酸：取1.0 g色氨酸，溶于100 mL无菌去离子水中，使其浓度为10 g/L。过滤除菌后使用；CAS检测液：溶液A：将0.079的CAS溶于50 mL去离子水中，再加入10 mL 1 mmol/L的FeCl3溶液(含有10 mmol/L的HCl)；溶液B：将0.069的HDTMA溶于40 mL的去离子水中；溶液C：将A溶液沿着烧杯内壁缓缓加入到B溶液中，轻轻晃动，使溶液A、B混匀，得到溶液C:CAS蓝色检测液。卡那霉素，氨苄青霉素：分别取0.1 g卡那霉素和氨苄青霉素溶于100 mL去离子水中，过滤除菌后使用；氯霉素：取0.1 g氯霉素溶于100 mL乙醇中； BTB：0.1 g BTB溶于20 mL乙醇，制成0.5% 的BTB乙醇溶液；10 mM正磷酸（磷酸浓度为14.6 mol/L）：取磷酸20.5479 μL加去离子水定容至30 mL，浓度为10 mM/L；Reagon：1 mL 0.5 M FeCl3·7H2O与49 mL 35% 的HClO4混合，其中HClO4浓度为70% ；Griess试剂：A液：对氨基苯磺酸，0.8 g，溶解于100 mL的冰醋酸中。B液：1-萘胺，0.5 g，溶解于100 mL冰醋酸中。A、B液等量取用。 甲基红：在0.01 mL乙醇中溶解0.002 g甲基红，加9.99 mL水。1.3 实验方法1.3.1 革兰氏染色实验 取无油迹的载玻片，在载玻片上滴一滴无菌水或蒸馏水，用接种环挑取少量菌苔，于水滴边缘轻轻涂几下。自然风干后，在火焰上通过1～2次，以固定涂片。滴加结晶紫液，覆盖约1～2 min。之后，用水冲净结晶紫液。再滴加碘液以冲去残余水分，并覆盖约1 min。用水冲去碘液，将片上水甩干。将玻片倾斜，流滴95% 酒精液约20～30秒钟，立即用水冲净酒精。用番红液染1～2 min。最后用水洗净番红，用滤纸吸干表面水或风干，备镜检。红色为革兰氏染色阴性，蓝紫色为革兰氏染色阳性。1.3.2根瘤菌的抗重金属实验 制备培养基，灭菌后在其中加入经过过滤除菌的重金属溶液母液。使最终培养基中Cu2+浓度为0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L；Cd2+浓度为0 mg/L、20 mg/L、50 mg/L、100 mg/L。以不加重金属的培养基为对照。将分离纯化后的菌株点种在固体培养基上。培养5~7天后观察，把在不同浓度下生长的各菌株记录下来。选出对于重金属抗性良好的菌株作为后续研究对象。 为了进一步确定根瘤菌对重金属具体的抗性，以便于后续研究。配制含有Cd2+浓度为0 mg/L、15 mg/L、30 mg/L、50 mg/L的TY培养基，Cu2+浓度为0 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、75 mg/L、100 mg/L的TY培养基。将分离到的三株菌接入，摇床培养3天，观察菌株是否生长，并测定其OD值。1.3.3 根瘤菌产IAA、铁载体实验制备YN培养基。在试管内加入2.5 mL的YN液体培养基，以及色氨酸。使色氨酸终浓度为0.5 mg/mL。将根瘤菌接入其中。在30℃的恒温摇床中培养3天。3天后，将约为2.5 mL的发酵液离心，6000 r/min离心10 min，取上清液1 mL，加入50 μL10 mM的正磷酸，再加2 mL显色剂（reagon），黑暗下25℃显色30 min，测定530 nm波长下的吸光值。以不接菌的YN液体培养基同样反应作为对照调零。以浓度为0、25、50、75、100、150、200、250、300 mg/L的IAA标准液同法作标准曲线，计算发酵液中IAA的浓度。将供试菌株接种于含有YN培养基的试管中，30℃摇床150 r/min振荡培养。培养48 h取出，发酵液6000 r/min离心10 min去除菌体细胞，取2 mL上清液加2 mL CAS检测液，充分混匀，1 h后测定630 nm波长处的吸光值，以去离子水作对照调零。另取2 mL CAS检测液与2 mL未接菌的唯一碳源培养基上清液充分混匀，同法测定吸光值即为参比值（Ar）。测定铁载体时所需器皿需用6 N HCl浸泡，进行脱铁处理。1.3.4根瘤菌的DNA提取、PCR扩增及测序1.3.4.1根瘤菌的DNA提取将活化的根瘤菌接种到TY液体培养基上，取1 mL培养物装入1.5 mL的离心管中，8000 r/min离心1 min收集菌体；（2）去上清，加入550 μL 1*TE缓冲液重悬；（3）加10 mg/mL溶菌酶10 μL，37℃水浴2~4小时，或是37℃水浴过夜；（4）加50 μL 20% SDS，8 μL 20 mg/mL的蛋白酶K，混匀。55℃温水浴5小时，或65℃ 2小时，或37℃过夜，每隔15~20 min轻轻颠倒几下；（5）加200 μL，5 mol/L NaCl，80 μL CTAB，颠倒15次，12000 r/min，10 min，取上清约700 μL（用移液枪定量取用）；加入与上清等体积的酚氯仿/异戊醇（25:24:1），混匀。12000 r/min，10 min。将上清液转入新管；重复上述步骤（6）；向上清液中加入0.6倍体积的预冷的异丙醇（或2倍体积的无水乙醇），混匀。4℃下静置30 min。12000 r/min，离心10 min，收集核酸沉淀；用70% 已预冷的乙醇洗涤沉淀，12000 r/min，离心5 min，弃上清液；吹干，重溶于30~50 μL超纯水中，-20℃保存。1.3.4.2 PCR扩增及测序所用引物为：1492R、27F（1）反应体系为：50 μL反应体系混合物 24.0 μL1492R 1.0 μL27F 1.0 μL模板DNA 1.0 μL补ddH2O至 50.0 μL（2）PCR 反应程序及产物检测PCR 的反应程序为：初始变性 94℃ 3 min变性 94℃ 30 sec 复性 50℃ 45 sec延伸 72℃ 100 sec最后延伸 72℃ 7 min PCR结束后，取产物5 μL，与1 μL Loading buffer混匀后，在含EB的1% 琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳1 h。电泳结束后从琼脂糖凝胶中回收目的片段，用来测序。1.3.5根瘤菌的生理生化实验1.3.5.1根瘤菌的生长需盐性实验 选择适宜的培养基（TY），将菌株在TY液体培养基中活化18 h。将活化后的菌株加入含有不同NaCl浓度的TY液体培养基中（NaCl浓度为0 g/L、10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L），培养基要十分澄清。每个浓度下设置3个重复，以不接菌的为对照。培养24 h，观察是否能够生长。并于600 nm下测定其OD值。1.3.5.2根瘤菌生长适宜pH实验 选择适宜的培养基（TY），将菌株在TY液体培养基中活化18 h。将活化后的菌株接入TY液体培养基中（pH分别用pH计准确调至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0），每个条件下三个重复并且以没有接菌的作为对照。30℃振荡培养24 h，观察能否生长，并测定600 nm下其OD值。1.3.5.3根瘤菌抗抗生素特性实验 选取卡那霉素、氨苄青霉素、氯霉素3种抗生素分别溶解过滤除菌后加入到已灭菌的TY液体培养基中，其中氨苄青霉素和氯霉素终浓度分别为5、50、100、300 μg/mL，卡那霉素终浓度分别为5、50、100 μg/mL，以不加抗生素为对照，培养观察3~5天，记录菌株的生长状况。若能生长，为阳性记为“+”，否则为阴性，记为“-”。1.3.5.4根瘤菌对染料抗性实验将溴百里酚蓝、龙胆紫2种染料分别溶解到培养基中，使其终浓度都为0.1% ，以不加染料的培养基为对照，培养观察同上。若能生长，为阳性，记为“+”，否则为阴性，记为“-”。1.3.5.5根瘤菌淀粉水解实验将供试菌株在TY液体培养基中活化18 h。活化后的菌株接种到含有淀粉的培养基中，培养24 h左右（长出菌苔即可），滴加碘液，观察菌落周围是否有透明圈出现，如有透明圈则记为“+”，否则为“-”。1.3.5.6根瘤菌过氧化氢酶实验将供试菌株在TY液体培养基中活化18 h。活化后的供试菌株接种于培养基上，待菌苔长出后（24 h左右），滴加1 mL 3% 的H2O2立即检查结果，5 min内出现气泡者为阳性反应记为“+”，反之为阴性反应，记为“-”。1.3.5.7根瘤菌硝酸盐还原实验将硝酸盐液体培养基灭菌后接种经过活化的供试菌，以不接菌培养基为对照，分别培养1、3、5 d后用Griess试剂1 mL检查硝酸盐还原情况，出现粉红色、玫瑰红、棕色为还原阳性，若无颜色变化再加入1~2滴二苯胺试剂，出现蓝色为阴性结果，不呈现蓝色仍为阳性。1.3.5.8根瘤菌BTB产酸产碱反应将溴麝香草酚蓝配制为0.5% 的乙醇溶液，再溶解于TY液体培养基中，其终浓度为0. 5% ，接种菌株于培养基中，以不加BTB的培养基为对照，培养观察颜色变化，产酸变黄，产碱变蓝。1.3.5.9根瘤菌的M.R实验配制葡萄糖蛋白胨液体培养基，灭菌，分装试管，每管2.5 ml培养液，备用。将储藏菌种先在TY液体培养基内活化，然后接种到装有培养基的试管中，每个处理三个重复，以不接种根瘤菌的试管为对照。30℃，150 r/min，摇床培养 3~5 d（如为阴性可适当延长培养时间）后滴加甲基红试剂，观察并记录结果。红色为甲基红试验阳性反应，记录为“+”，黄色为甲基红试验阴性反应，记录为“-”。2. 结果与分析2.1根瘤菌的革兰氏染色结果将从耐重金属的苜蓿根瘤中分离出来的根瘤菌进行革兰氏染色后，结果显示为红色，即所分离到的菌株为革兰氏阴性菌。2.2根瘤菌的重金属抗性实验为了探究根瘤菌-豆科植物共生体系在重金属条件下的生长情况，首先要选出有重金属抗性的根瘤菌。通过设置含有Cu2+浓度为0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L；Cd2+浓度为0 mg/L、20 mg/L、50 mg/L、100 mg/L的培养基，筛选出在较高浓度的重金属胁迫下仍能有较好生长的根瘤菌。如下图所示，即为三株菌在不同种类重金属、不同浓度下的生长情况。 表2-1. 根瘤菌在含不同浓度的重金属培养基中的生长情况 Table2-1. The growth of strains in different heavy metal condition菌株Cd离子浓度（mg/L）Concentration of Cd2+Cu离子浓度（mg/L）Concentration of Cu2+strain0205010005010015020017＋＋＋－＋＋＋＋－19＋＋＋－＋＋＋＋－33＋＋＋－＋＋＋＋－ 注：“+”表示菌株在该浓度下有生长；“-”表示菌株在该浓度下无生长。为了进一步了解所筛选菌株抗重金属能力的变化，我们再次进行了试管实验。经过三天的培养，结果表明：在Cd2+浓度为15 mg/L时，三株菌仍能有较好的生长。但是在Cd2+浓度为50 mg/L时，三株菌生长量极少。这说明：对于三株菌而言，它们对于Cd2+的耐受范围大约在0~50 mg/L。具体情况，如下图所示。图2-1. 菌株在不同镉离子浓度下的生长情况Fig2-1. The growth of the rhizobia strains in different concentration Cd2+ 与在含有不同浓度Cd2+的培养基中不同的是，三株菌在含有不同浓度Cu2+的培养基中均生长良好。即使在Cu2+浓度高达100 mg/L时，三株菌依然具有较强的生长能力，如图2-2。说明三株菌均对铜的耐受性较好。此外，如表2-1平板实验的结果所示，三株菌在Cu2+浓度为150 mg/L时仍能在平板上生长。可见，三株菌对于铜的耐受能力十分强。在面对两种不同的重金属时，三株菌均显示出对于铜的耐受性明显强于镉。即相对而言镉对菌株的伤害远大于铜。可见同一菌株对于不同种类的重金属耐受性是不同的[22]。 图2-2. 菌株在不同铜离子浓度下的生长状况 Fig.2-2 The growth of the rhizobia strains in different concentration Cu2+ 2.3根瘤菌产IAA、铁载体能力的实验IAA是一种植物生长激素，以很低的浓度就可以发挥作用。根瘤菌可以通过分泌IAA促进植物的生长，提高植物的生物量[3]。铁载体是微生物细胞所需要的一种低分子量化合物，有助于微生物对于铁元素的摄取和吸收。研究根瘤菌产IAA和铁载体的能力对于判断根瘤菌对促进植物及其本身的生长能力有较大的意义。在本实验中，所有菌株均未检测到有铁载体的产生。结果显示，所有菌株产IAA的能力都较高。IAA实验结果中反应颜色很深，如图2-3所示。17号菌株产IAA的能力对比IAA标准浓度曲线计算结果为286 mg/L，19号菌株为307 mg/L，而33号菌株已高达322 mg/L。三株菌显示出的产IAA能力均偏高，在正常情况下，其分泌IAA的能力远远低于这个结果。出现这种结果的原因可能是培养基中色氨酸的浓度偏高，导致IAA产量过高[23]。但是，具体原因有待进一步探究。图2-3. 菌株产IAA的结果Fig.2-3 The result of strains release IAA注：左起分别为CK；33的三个重复；19的三个重复；17的三个重复2.4根瘤菌的16S rDNA PCR结果图中即为几个菌株进行16S rDNA PCR的结果，可以明显的观察到几个菌株的分子量约为1500 bp。图中没有条带的部分即为空白对照，说明没有感染到杂菌。 图2-4.菌株的16S rDNA PCR 结果 Fig.2-4 The 16S rDNA PCR result of strains 注：泳道1：DL2000 DNA marker；泳道2~4：空白对照；泳道5~7：17、19、33三个菌株2.5根瘤菌的生理生化实验2.5.1根瘤菌的耐盐性实验目前，我国大约有1亿亩的盐碱性土地[24]。研究根瘤菌的耐盐性对于未来将根瘤菌-豆科植物共生体系在实际中应用有很大意义，只有体系中所用根瘤菌具有耐盐性，共生体系才有可能在盐碱性土地上较好地生长。所以把根瘤菌的耐盐性作为根瘤菌抗逆性研究的一项指标。本实验中，17、19、33号菌株在含NaCl浓度为10 g/L~30 g/L的培养基中均有较好的生长状况。但是17号菌株在含NaCl 浓度为40、50 g/L的培养基中仍能有一定的生长，而19、33号菌株则在NaCl 浓度为40 g/L时生长能力就较差，当其浓度上升为50 g/L时，几乎完全没有生长。所以三株菌对于盐均有一定的耐受性，但是17号菌株的耐受能力比19、33更好。具体情况见图2-5。 图2-5 不同NaCl浓度下根瘤菌的生长状况 Fig2-5. The growth of the rhizobia in diffrernt concentrations NaCl 2.5.2 根瘤菌的生长适宜pH实验环境中pH对于植物的生长有较大的影响[25]，若能选择合适的、具有良好耐酸性、耐碱性的根瘤菌接种到植物上，对于提高植物的生长量和品质有较大的意义。在本实验中，设置了一系列pH，为4、5、6、7、8、9、10、11、12九个梯度。发现三株菌对于pH的耐受性范围较广，在pH值为6~11时均有菌株可以生长，并且在pH为6~9时生长情况最好。但是，三株菌对酸性环境的抗性都较差，在pH为4时，几乎无法生长。在pH为5时，也仅有极少量的生长。但是在偏酸、中性、偏碱、碱性的环境中仍有较好的生长能力。其中33号菌株在pH值为11时，其生长状况明显好于17，19号菌株，说明33号菌株对于碱性环境的耐受能力更强。具体情况见图2-6。 图2-6.不同pH下根瘤菌的生长 Fig2-6.The growth of the rhizobia strains in different pH2.5.3 根瘤菌对抗生素抗性、染料抗性实验 根瘤菌对抗生素的抗性、染料的抗性研究，都是对于根瘤菌理化性质的基础研究。研究发现三株菌对于卡那霉素的抗性都较差，在卡那霉素的浓度为50 μg/mL时，19号菌株就无法生长。当其浓度上升为100 μg/mL时，三株菌均无法生长。但是它们对于氨苄青霉素的抗性都比较好，17号菌株甚至在浓度为300 μg/mL的氨苄青霉素培养基上仍有少量生长。三株菌实验结果显示对于300 μg/mL的氯霉素均无抗性。三株菌在结晶紫上均无法生长，耐性较差。对于溴麝香草酚蓝的耐性有一定差异。总体来看，17号菌株的抗逆能力更强。具体情况见下表。 表2-2 根瘤菌对抗生素及染料抗性Table 2-2 The resistance of the rhizobia strains to antibiotic and dye菌株strain 氯霉素浓度（μg/mL）Concentration of chloramphenicol卡那霉素浓度 （μg/mL）Concentration of kanamycin氨苄青霉素浓度（μg/mL）Concentration ofperbritin溴百里香草粉蓝BTB结晶紫Crystal violet55010030055010055010030017＋＋＋－＋＋－＋＋＋＋＋－19＋＋＋－＋－－＋＋＋－－－33＋＋＋－＋＋－＋＋＋－＋－注：有菌生长记为“+”，不生长记为“-”2.5.4 根瘤菌的其他理化性质对于菌株的理化性质的分析研究是研究探讨一种菌株有特异性表现的原因的基础。如：淀粉水解实验，是判断所分离出的根瘤菌可否利用淀粉作为唯一碳源。经过实验，显示三株菌均无法利用淀粉作为唯一碳源。探究菌株是否产生过氧化氢酶是因为可以据此判断所筛选出的菌是好氧菌还是厌氧菌。因为过氧化氢酶能将过氧化氢分解为水和氧。一般厌氧细菌不能产生过氧化氢酶，而好氧细菌和某些兼性厌氧的细菌可以产生过氧化氢酶[26]。硝酸盐还原实验可以判断菌株是否具有硝酸盐还原能力；而甲基红实验则是判断菌株的代谢过程中是否会产酸。若产酸，则培养基会变红、为阳性反应，反之为黄色、为阴性反应。通过BTB产酸产碱反应可以初步推测根瘤菌是快生型根瘤菌还是慢生型根瘤菌。通常情况下，产酸为快生型根瘤菌，产碱为慢生型根瘤菌[27]。研究根瘤菌的理化性质对于分析其代谢途径、研究其抗性产生原因有着较为重要的意义。本研究中所探究的三株菌淀粉水解能力为阴性，过氧化氢酶解为阳性说明三株菌均无淀粉水解能力，非厌氧菌。此外，三株菌具有硝酸盐还原能力，产碱，甲基红实验结果显示为阴性。 图2-7. BTB 实验 图2-8.硝酸盐还原能力实验 Fig.2-7 BTB Test Fig.2-8 Nitrate reduction test 注：从左起依次为CK（不加BTB）；不接菌；接17号菌； 注：从左起依次为17号菌；19号菌；33号菌 接19号菌；接33号菌具体实验结果，如下表所示。 表2-3 根瘤菌其他生理生化特征 Table2-3 Physiological Biochemical Characteristics of the rhizobia strains菌株strain淀粉水解Amylum Hydrolysis 过氧化氢酶Catalase Test硝酸盐还原能力Nitrate reduction test甲基红实验M.R TestBTB实验BTB Test17－＋＋－产碱19－＋＋－产碱33－＋＋－产碱 注：阳性反应记为“+”；阴性反应记为“-”3.结论与讨论3.1讨论 所用菌株是从在重金属胁迫条件下生长的苜蓿上分离的。因而根瘤菌、苜蓿及其共生体系对于重金属都会有一定的抗性。但是，我国境内有多种豆科植物，我们需要找出与多种豆科植物均能产生良好共生固氮效果的菌株，为修复重金属污染地、改良土壤结构提供参考。为此，能够获取抗逆性较好的根瘤菌是前提，同时也要寻找具有良好抗逆性的共生组合，这是本研究的意义所在。本研究最终筛选出了三株抗逆性较好的根瘤菌，这为后续的实验提供了前提。但是，在研究过程中，对于所筛选、使用的三株根瘤菌未能确定其具体属于哪一种属，因此仍需通过对筛选出来的根瘤菌测序、绘制进化树来分析探究，以确定其具体的属、种。同时，在研究抗逆性时，有的胁迫条件下没有能够连续多测试几代，所以实验结果可能与实际存在一定的差异。本研究中发现的具有较好抗逆性的菌株，对于其是否能够通过回接到苜蓿上而发生结瘤现象仍是未知的。为此，仍需进行这几株根瘤菌与苜蓿的回接实验。同时，还需要探明这几株根瘤菌是否能与其他豆科植物共生结瘤，这也是仍然需要继续探究的一个方面。3.2结论 本研究中，通过对于重金属耐性菌株的筛选，选出了作为研究目标的3株菌，为根瘤菌17，19，33。三株菌均显示出对于重金属铜和镉有一定的耐受能力。三株菌均具有分泌IAA的能力，但是均无分泌铁载体的能力。在耐盐性方面，17号菌株的耐受范围为0~50 g/L，19、33号菌株的耐受范围为0~40 g/L。在探究三株菌对于酸碱度的耐受性方面，三株菌均表现为对于酸性生长环境无耐受性。但是，在pH为 6~9时，都能较好生长。在对其他一些生理生化特性进行研究时，三株菌的反应是相类似的。都不能把淀粉作为唯一碳源，都不是厌氧菌，并且都具有硝酸盐还原能力，这些与根瘤菌的普遍性质一样。在BTB产酸产碱反应中均表现为产碱，三株菌可能为慢生型根瘤菌。三株菌均可以用作后续研究的实验材料。致谢 张 敏 2015年5月6日参考文献[ 1 ] Ryan JA,Pahren HR,Lucas JB. 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目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1. 实验材料与方法 3
1.1 实验仪器 3
1.2 实验材料和试剂 3
1.3 实验方法 4
1.3.1 革兰氏染色实验 4
1.3.2 根瘤菌的抗重金属实验 4
1.3.3 根瘤菌产IAA、铁载体能力实验 4
1.3.4 根瘤菌的DNA提取、PCR扩增 4
1.3.5 根瘤菌生理生化实验 5
1.3.5.1 根瘤菌生长耐盐性实验 5
1.3.5.2 根瘤菌生长适宜pH的实验 5
1.3.5.3 根瘤菌对抗生素抗性实验 5
1.3.5.4 根瘤菌对染料的抗性实验 5
1.3.5.5 根瘤菌的淀粉水解实验 6
1.3.5.6根瘤菌的过氧化氢酶解实验 6
1.3.5.7 根瘤菌的硝酸盐还原实验 6
1.3.5.8 根瘤菌的BTB反应实验 6
1.3.5.9 根瘤菌的M.R实验 6
2. 结果与分析 6
2.1 根瘤菌的革兰氏染色实验 6
2.2 根瘤菌对重金属的抗性 6
2.3 根瘤菌产IAA、铁载体的能力 7
2.4 根瘤菌的16s rDNA PCR结果 8
2.5 根瘤菌的生理生化性质 8
2.5.1 根瘤菌生长耐盐性实验结果 8
2.5.2 根瘤菌生长适宜pH的实验结果 9
2.5.3 根瘤菌对抗生素、染料抗性实验结果 10
2.5.4 根瘤菌其他生物学特性实验结果 10
3. 结论与讨论 11
3.1讨论 11
3.2结论 11
致 谢 12
参考文献 12
耐重金属苜蓿根瘤菌的分离筛选及其生物学特性
引言
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
nt characteristics, we analyzed resistance to heavy metal of these strains and their abilities of releasing IAA and icon carriers. Besides these, we also did some research about their biological characteristics. The results showed that strains 17, 19, 33 had the resistance to heavy metal of Cu and Cd. In the salt tolerance experiment, strain 17 had high tolerance to salt. In the acid and alkali resistance experiments, results showed that the strains can grow in the slightly acid, neutral and slightly alkaline condition. They can grow on the pH value of 6~9. When the pH value up to 11, strains 17, 19, 33 can still grow in the culture, which means these strains had certain tolerance on alkali. The three strains showed feminine gender in the amylum hydrolysis test and masculine gender in the catalase test and nitrate reduction test. In the BTB test, all of the results showed alkali. The results of this study can provide a basis and?the best?choice of material for the further?research of using plants combined with microorganism to restore the soil which was polluted by heavy metal. Key Words: rhizobia; the resistance to heavy metal; physiological and biochemical characteristics近年来，随着工农业的发展、人类活动的增加，产生了大量的污染物。这些污染物进入土壤并逐渐积累，导致土壤受到严重污染。其中一种主要污染是重金属污染。由于重金属污染物具有在土壤中移动性小，不易随水淋滤，不被微生物降解的特点，重金属可能会通过食物链进入人体引起慢性中毒[1~2]。因此，如何修复重金属污染土壤已成为生态保护的热点问题。在重金属污染地，重金属毒性和养分不足是重金属污染地植被恢复的主要限制因子，而氮素的极端不足又是养分不足的核心问题[3~4]，因此提高重金属污染地氮素含量水平成为重金属污染地生态修复的首要工作。生物固氮作为一种在自然生态系统中氮的来源的主要方式十分具有研究意义。在生物固氮中，豆科植物-根瘤菌固氮体系每年的固氮量可以达到全球生物固氮量的65% 以上，是一种十分重要的固氮方式[5~6]。同时，根瘤菌与豆科植物的共生固氮体系具有成本低廉、不污染环境的特点。另外，该体系还可以起到改良土壤结构，增加土壤肥力的作用[7~8]。所以，探讨如何提高该体系下的固氮能力对于修复重金属污染土壤，维持生态环境有着重要意义。因而豆科植物与根瘤菌的共生固氮作用是近年来研究的热点问题[9]。 根瘤菌是一类能促使植物异常增生的革兰氏染色为阴性的需氧杆菌。通常以鞭毛运动，没有芽孢。能够利用多种碳水化合物。根瘤菌能够与豆科植物共生，形成根瘤并能够通过固定空气中的氮气为植物提供营养。根瘤菌在根瘤组织中存在有三种主要的形态：(1)在幼小的根瘤中，是很小的有鞭毛能运动的短杆菌;(2)在根瘤发育的过程中，菌体逐渐变大，无鞭毛，呈现环节状，依然能运动的短杆菌，有些种会一端膨大或是分支成不同的形态，处于这种形态阶段的根瘤菌称类菌体;(3)随着根瘤衰败，类菌体崩裂，变成很小的球状和短杆状细菌[10]。根瘤菌与豆科植物的共生体系在许多重金属污染的废弃地依然有着较为良好的长势，说明根瘤菌的生命力比较旺盛，对于环境的适应能力较为显著[11~13]。多项研究结果表明，许多根瘤菌对于不同的重金属均有一定的抗性[14~15]。根瘤菌对重金属离子抗性较高的原因可能有以下几个方面：(1)根瘤菌可以使细胞外层屏障降低对重金属离子的通透性，其细胞外层的相关屏障包括脂多糖等，可以与重金属离子形成复合物，从而使金属离子对细胞的毒害性大大降低;(2)细胞的外排作用，避免毒素在细胞内的积累[8、16]。根瘤菌对于重金属的耐性在一定程度上保证了豆科植物的生长情况，使其避免受到重金属土壤的伤害，并促进豆科植物的生长。此外，前人对于豆科植物在生态恢复等方面的应用也进行了相关的概述，提出豆科植物不仅抗逆性较强，同时具有生长范围广的优点[17]。而且也有人提出豆科植物对于重金属离子耐受性的原因可能包括：豆科植物可以通过外植体途径和共质体途径来抵抗重金属离子对于植物的伤害[8]。由此可见，豆科植物和根瘤菌对于重金属离子都有一定的抗性，两者相互结合的修复方式也有一定的优点，如：修复效果好，无污染，提高修复效率，可以克服单一修复方式的局限性[18]。但是，由于存在“同一种植物在不同生态环境中可与不同根瘤菌结瘤固氮，而在生态地理环境相近的地区中，同一根瘤菌可与多种豆科植物共生”的现象[19]。也就是说，根瘤菌-豆科植物的结合受到环境等其他因素的影响较大[6]。因此，我们在利用根瘤菌-豆科植物的共生体系时需要针对具体的根瘤菌以及宿主植物在特定的环境下进行研究。此外，有研究发现，很多时候根瘤菌对于植物的促生作用并不十分明显。究其原因，根瘤菌本身的抗逆性可能是原因之一。但是，还有可能是因为根瘤菌与豆科植物的特异性作用有关[20~21]。因此，为了能够使根瘤菌与豆科植物的共生固氮体系取得较为良好的效果，从而为该体系修复重金属污染土壤的研究提供一定的依据。本研究从耐重金属的苜蓿根瘤中分离菌株出发，筛选得到抗重金属、耐盐性、耐碱性等抗逆性良好的菌株。并且探索这些菌株是否有其他相对优良的理化性质，以便于为后续构建良好的根瘤菌-豆科植物共生体系、研究该共生体系在重金属污染条件下的生长状况，及修复重金属污染土壤的能力提供一定的依据和材料。1. 实验材料与方法1.1 实验仪器电子天平、高压灭菌锅、恒温摇床、恒温培养箱、微量移液器、分光光度计 1.2 实验材料和试剂1.2.1菌株三株根瘤菌（菌株编号17，19，33），实验室保存，分离自重金属污染土壤中生长的苜蓿根瘤。1.2.2培养基和试剂1.2.2.1 培养基YMA固体培养基：甘露醇10.0?g，K2HPO4?0.5?g，酵母粉1.0?g，谷氨酸钠0.5 g，NaCl 0.05 g，solution A(MgSO4·7H2O 1.0 g，distilled water 100 mL)10 mL，solution B(CaCl2·2H2O?5.28 g，distilled water 100 mL)1 mL，solution C(FeCl3·6H2O 666 mg，distilled water 100 mL)1 mL，固体琼脂2% ；YN液体培养基：蔗糖10.0 g，(NH4)2SO4 1.0 g，K2HPO4 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.1 g，酵母粉0.5 g；TY液体培养基：胰蛋白胨5.0?g，酵母粉3.0?g，无水CaCl2?0.647?g，pH?7.0～7.2；?Fahraeus无氮营养液：Na2HPO4·2H2O?0.15?g，CaCl2·2H2O?0.10?g，MgSO4·7H2O?0.12?g，KH2PO4?0.10?g，柠檬酸铁0.005?g；?微量元素液：H3BO4?2.86?g，MnSO4·4H2O?2.03 g，Na2Mo4·7H2O?0.08 g，ZnSO4·7H2O?0.22?g，CuSO4·5H2O?0.08?g（使用时取1 mL加入1 L?Fahraeus无氮营养液中）；淀粉培养基：胰蛋白胨10.0 g，牛肉膏5.0 g，NaCl 5.0 g， 淀粉2.0 g，pH?7.0～7.2；硝酸盐培养基：胰蛋白胨5.0 g，KNO3 0.2 g；葡萄糖培养基：胰蛋白胨5.0 g，葡萄糖5.0 g，K2HPO4 0.5 g，pH?7.0～7.2；以上培养基、营养液除特殊说明外，配制时均用蒸馏水定容至1000?mL，在121℃灭菌25?min。1.2.2.2试剂草酸铵结晶紫染液：溶液A：结晶紫2.0 g，95% 酒精20 mL。溶液B：草酸铵0.8 g，蒸馏水95 mL；碘液：碘片1.0 g，碘化钾2.0 g，蒸馏水300 mL；番红：番红2.5% 的酒精溶液20 mL，蒸馏水80 mL；Cu2+，Cd2+母液均为10 g/L，过滤除菌后使用；10*TE buffer：100 mM Tris·HCl，10 mM EDTA 1 L；色氨酸：取1.0 g色氨酸，溶于100 mL无菌去离子水中，使其浓度为10 g/L。过滤除菌后使用；CAS检测液：溶液A：将0.079的CAS溶于50 mL去离子水中，再加入10 mL 1 mmol/L的FeCl3溶液(含有10 mmol/L的HCl)；溶液B：将0.069的HDTMA溶于40 mL的去离子水中；溶液C：将A溶液沿着烧杯内壁缓缓加入到B溶液中，轻轻晃动，使溶液A、B混匀，得到溶液C:CAS蓝色检测液。卡那霉素，氨苄青霉素：分别取0.1 g卡那霉素和氨苄青霉素溶于100 mL去离子水中，过滤除菌后使用；氯霉素：取0.1 g氯霉素溶于100 mL乙醇中； BTB：0.1 g BTB溶于20 mL乙醇，制成0.5% 的BTB乙醇溶液；10 mM正磷酸（磷酸浓度为14.6 mol/L）：取磷酸20.5479 μL加去离子水定容至30 mL，浓度为10 mM/L；Reagon：1 mL 0.5 M FeCl3·7H2O与49 mL 35% 的HClO4混合，其中HClO4浓度为70% ；Griess试剂：A液：对氨基苯磺酸，0.8 g，溶解于100 mL的冰醋酸中。B液：1-萘胺，0.5 g，溶解于100 mL冰醋酸中。A、B液等量取用。 甲基红：在0.01 mL乙醇中溶解0.002 g甲基红，加9.99 mL水。1.3 实验方法1.3.1 革兰氏染色实验 取无油迹的载玻片，在载玻片上滴一滴无菌水或蒸馏水，用接种环挑取少量菌苔，于水滴边缘轻轻涂几下。自然风干后，在火焰上通过1～2次，以固定涂片。滴加结晶紫液，覆盖约1～2 min。之后，用水冲净结晶紫液。再滴加碘液以冲去残余水分，并覆盖约1 min。用水冲去碘液，将片上水甩干。将玻片倾斜，流滴95% 酒精液约20～30秒钟，立即用水冲净酒精。用番红液染1～2 min。最后用水洗净番红，用滤纸吸干表面水或风干，备镜检。红色为革兰氏染色阴性，蓝紫色为革兰氏染色阳性。1.3.2根瘤菌的抗重金属实验 制备培养基，灭菌后在其中加入经过过滤除菌的重金属溶液母液。使最终培养基中Cu2+浓度为0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L；Cd2+浓度为0 mg/L、20 mg/L、50 mg/L、100 mg/L。以不加重金属的培养基为对照。将分离纯化后的菌株点种在固体培养基上。培养5~7天后观察，把在不同浓度下生长的各菌株记录下来。选出对于重金属抗性良好的菌株作为后续研究对象。 为了进一步确定根瘤菌对重金属具体的抗性，以便于后续研究。配制含有Cd2+浓度为0 mg/L、15 mg/L、30 mg/L、50 mg/L的TY培养基，Cu2+浓度为0 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、75 mg/L、100 mg/L的TY培养基。将分离到的三株菌接入，摇床培养3天，观察菌株是否生长，并测定其OD值。1.3.3 根瘤菌产IAA、铁载体实验制备YN培养基。在试管内加入2.5 mL的YN液体培养基，以及色氨酸。使色氨酸终浓度为0.5 mg/mL。将根瘤菌接入其中。在30℃的恒温摇床中培养3天。3天后，将约为2.5 mL的发酵液离心，6000 r/min离心10 min，取上清液1 mL，加入50 μL10 mM的正磷酸，再加2 mL显色剂（reagon），黑暗下25℃显色30 min，测定530 nm波长下的吸光值。以不接菌的YN液体培养基同样反应作为对照调零。以浓度为0、25、50、75、100、150、200、250、300 mg/L的IAA标准液同法作标准曲线，计算发酵液中IAA的浓度。将供试菌株接种于含有YN培养基的试管中，30℃摇床150 r/min振荡培养。培养48 h取出，发酵液6000 r/min离心10 min去除菌体细胞，取2 mL上清液加2 mL CAS检测液，充分混匀，1 h后测定630 nm波长处的吸光值，以去离子水作对照调零。另取2 mL CAS检测液与2 mL未接菌的唯一碳源培养基上清液充分混匀，同法测定吸光值即为参比值（Ar）。测定铁载体时所需器皿需用6 N HCl浸泡，进行脱铁处理。1.3.4根瘤菌的DNA提取、PCR扩增及测序1.3.4.1根瘤菌的DNA提取将活化的根瘤菌接种到TY液体培养基上，取1 mL培养物装入1.5 mL的离心管中，8000 r/min离心1 min收集菌体；（2）去上清，加入550 μL 1*TE缓冲液重悬；（3）加10 mg/mL溶菌酶10 μL，37℃水浴2~4小时，或是37℃水浴过夜；（4）加50 μL 20% SDS，8 μL 20 mg/mL的蛋白酶K，混匀。55℃温水浴5小时，或65℃ 2小时，或37℃过夜，每隔15~20 min轻轻颠倒几下；（5）加200 μL，5 mol/L NaCl，80 μL CTAB，颠倒15次，12000 r/min，10 min，取上清约700 μL（用移液枪定量取用）；加入与上清等体积的酚氯仿/异戊醇（25:24:1），混匀。12000 r/min，10 min。将上清液转入新管；重复上述步骤（6）；向上清液中加入0.6倍体积的预冷的异丙醇（或2倍体积的无水乙醇），混匀。4℃下静置30 min。12000 r/min，离心10 min，收集核酸沉淀；用70% 已预冷的乙醇洗涤沉淀，12000 r/min，离心5 min，弃上清液；吹干，重溶于30~50 μL超纯水中，-20℃保存。1.3.4.2 PCR扩增及测序所用引物为：1492R、27F（1）反应体系为：50 μL反应体系混合物 24.0 μL1492R 1.0 μL27F 1.0 μL模板DNA 1.0 μL补ddH2O至 50.0 μL（2）PCR 反应程序及产物检测PCR 的反应程序为：初始变性 94℃ 3 min变性 94℃ 30 sec 复性 50℃ 45 sec延伸 72℃ 100 sec最后延伸 72℃ 7 min PCR结束后，取产物5 μL，与1 μL Loading buffer混匀后，在含EB的1% 琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳1 h。电泳结束后从琼脂糖凝胶中回收目的片段，用来测序。1.3.5根瘤菌的生理生化实验1.3.5.1根瘤菌的生长需盐性实验 选择适宜的培养基（TY），将菌株在TY液体培养基中活化18 h。将活化后的菌株加入含有不同NaCl浓度的TY液体培养基中（NaCl浓度为0 g/L、10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L），培养基要十分澄清。每个浓度下设置3个重复，以不接菌的为对照。培养24 h，观察是否能够生长。并于600 nm下测定其OD值。1.3.5.2根瘤菌生长适宜pH实验 选择适宜的培养基（TY），将菌株在TY液体培养基中活化18 h。将活化后的菌株接入TY液体培养基中（pH分别用pH计准确调至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0），每个条件下三个重复并且以没有接菌的作为对照。30℃振荡培养24 h，观察能否生长，并测定600 nm下其OD值。1.3.5.3根瘤菌抗抗生素特性实验 选取卡那霉素、氨苄青霉素、氯霉素3种抗生素分别溶解过滤除菌后加入到已灭菌的TY液体培养基中，其中氨苄青霉素和氯霉素终浓度分别为5、50、100、300 μg/mL，卡那霉素终浓度分别为5、50、100 μg/mL，以不加抗生素为对照，培养观察3~5天，记录菌株的生长状况。若能生长，为阳性记为“+”，否则为阴性，记为“-”。1.3.5.4根瘤菌对染料抗性实验将溴百里酚蓝、龙胆紫2种染料分别溶解到培养基中，使其终浓度都为0.1% ，以不加染料的培养基为对照，培养观察同上。若能生长，为阳性，记为“+”，否则为阴性，记为“-”。1.3.5.5根瘤菌淀粉水解实验将供试菌株在TY液体培养基中活化18 h。活化后的菌株接种到含有淀粉的培养基中，培养24 h左右（长出菌苔即可），滴加碘液，观察菌落周围是否有透明圈出现，如有透明圈则记为“+”，否则为“-”。1.3.5.6根瘤菌过氧化氢酶实验将供试菌株在TY液体培养基中活化18 h。活化后的供试菌株接种于培养基上，待菌苔长出后（24 h左右），滴加1 mL 3% 的H2O2立即检查结果，5 min内出现气泡者为阳性反应记为“+”，反之为阴性反应，记为“-”。1.3.5.7根瘤菌硝酸盐还原实验将硝酸盐液体培养基灭菌后接种经过活化的供试菌，以不接菌培养基为对照，分别培养1、3、5 d后用Griess试剂1 mL检查硝酸盐还原情况，出现粉红色、玫瑰红、棕色为还原阳性，若无颜色变化再加入1~2滴二苯胺试剂，出现蓝色为阴性结果，不呈现蓝色仍为阳性。1.3.5.8根瘤菌BTB产酸产碱反应将溴麝香草酚蓝配制为0.5% 的乙醇溶液，再溶解于TY液体培养基中，其终浓度为0. 5% ，接种菌株于培养基中，以不加BTB的培养基为对照，培养观察颜色变化，产酸变黄，产碱变蓝。1.3.5.9根瘤菌的M.R实验配制葡萄糖蛋白胨液体培养基，灭菌，分装试管，每管2.5 ml培养液，备用。将储藏菌种先在TY液体培养基内活化，然后接种到装有培养基的试管中，每个处理三个重复，以不接种根瘤菌的试管为对照。30℃，150 r/min，摇床培养 3~5 d（如为阴性可适当延长培养时间）后滴加甲基红试剂，观察并记录结果。红色为甲基红试验阳性反应，记录为“+”，黄色为甲基红试验阴性反应，记录为“-”。2. 结果与分析2.1根瘤菌的革兰氏染色结果将从耐重金属的苜蓿根瘤中分离出来的根瘤菌进行革兰氏染色后，结果显示为红色，即所分离到的菌株为革兰氏阴性菌。2.2根瘤菌的重金属抗性实验为了探究根瘤菌-豆科植物共生体系在重金属条件下的生长情况，首先要选出有重金属抗性的根瘤菌。通过设置含有Cu2+浓度为0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L；Cd2+浓度为0 mg/L、20 mg/L、50 mg/L、100 mg/L的培养基，筛选出在较高浓度的重金属胁迫下仍能有较好生长的根瘤菌。如下图所示，即为三株菌在不同种类重金属、不同浓度下的生长情况。 表2-1. 根瘤菌在含不同浓度的重金属培养基中的生长情况 Table2-1. The growth of strains in different heavy metal condition菌株Cd离子浓度（mg/L）Concentration of Cd2+Cu离子浓度（mg/L）Concentration of Cu2+strain0205010005010015020017＋＋＋－＋＋＋＋－19＋＋＋－＋＋＋＋－33＋＋＋－＋＋＋＋－ 注：“+”表示菌株在该浓度下有生长；“-”表示菌株在该浓度下无生长。为了进一步了解所筛选菌株抗重金属能力的变化，我们再次进行了试管实验。经过三天的培养，结果表明：在Cd2+浓度为15 mg/L时，三株菌仍能有较好的生长。但是在Cd2+浓度为50 mg/L时，三株菌生长量极少。这说明：对于三株菌而言，它们对于Cd2+的耐受范围大约在0~50 mg/L。具体情况，如下图所示。图2-1. 菌株在不同镉离子浓度下的生长情况Fig2-1. The growth of the rhizobia strains in different concentration Cd2+ 与在含有不同浓度Cd2+的培养基中不同的是，三株菌在含有不同浓度Cu2+的培养基中均生长良好。即使在Cu2+浓度高达100 mg/L时，三株菌依然具有较强的生长能力，如图2-2。说明三株菌均对铜的耐受性较好。此外，如表2-1平板实验的结果所示，三株菌在Cu2+浓度为150 mg/L时仍能在平板上生长。可见，三株菌对于铜的耐受能力十分强。在面对两种不同的重金属时，三株菌均显示出对于铜的耐受性明显强于镉。即相对而言镉对菌株的伤害远大于铜。可见同一菌株对于不同种类的重金属耐受性是不同的[22]。 图2-2. 菌株在不同铜离子浓度下的生长状况 Fig.2-2 The growth of the rhizobia strains in different concentration Cu2+ 2.3根瘤菌产IAA、铁载体能力的实验IAA是一种植物生长激素，以很低的浓度就可以发挥作用。根瘤菌可以通过分泌IAA促进植物的生长，提高植物的生物量[3]。铁载体是微生物细胞所需要的一种低分子量化合物，有助于微生物对于铁元素的摄取和吸收。研究根瘤菌产IAA和铁载体的能力对于判断根瘤菌对促进植物及其本身的生长能力有较大的意义。在本实验中，所有菌株均未检测到有铁载体的产生。结果显示，所有菌株产IAA的能力都较高。IAA实验结果中反应颜色很深，如图2-3所示。17号菌株产IAA的能力对比IAA标准浓度曲线计算结果为286 mg/L，19号菌株为307 mg/L，而33号菌株已高达322 mg/L。三株菌显示出的产IAA能力均偏高，在正常情况下，其分泌IAA的能力远远低于这个结果。出现这种结果的原因可能是培养基中色氨酸的浓度偏高，导致IAA产量过高[23]。但是，具体原因有待进一步探究。图2-3. 菌株产IAA的结果Fig.2-3 The result of strains release IAA注：左起分别为CK；33的三个重复；19的三个重复；17的三个重复2.4根瘤菌的16S rDNA PCR结果图中即为几个菌株进行16S rDNA PCR的结果，可以明显的观察到几个菌株的分子量约为1500 bp。图中没有条带的部分即为空白对照，说明没有感染到杂菌。 图2-4.菌株的16S rDNA PCR 结果 Fig.2-4 The 16S rDNA PCR result of strains 注：泳道1：DL2000 DNA marker；泳道2~4：空白对照；泳道5~7：17、19、33三个菌株2.5根瘤菌的生理生化实验2.5.1根瘤菌的耐盐性实验目前，我国大约有1亿亩的盐碱性土地[24]。研究根瘤菌的耐盐性对于未来将根瘤菌-豆科植物共生体系在实际中应用有很大意义，只有体系中所用根瘤菌具有耐盐性，共生体系才有可能在盐碱性土地上较好地生长。所以把根瘤菌的耐盐性作为根瘤菌抗逆性研究的一项指标。本实验中，17、19、33号菌株在含NaCl浓度为10 g/L~30 g/L的培养基中均有较好的生长状况。但是17号菌株在含NaCl 浓度为40、50 g/L的培养基中仍能有一定的生长，而19、33号菌株则在NaCl 浓度为40 g/L时生长能力就较差，当其浓度上升为50 g/L时，几乎完全没有生长。所以三株菌对于盐均有一定的耐受性，但是17号菌株的耐受能力比19、33更好。具体情况见图2-5。 图2-5 不同NaCl浓度下根瘤菌的生长状况 Fig2-5. The growth of the rhizobia in diffrernt concentrations NaCl 2.5.2 根瘤菌的生长适宜pH实验环境中pH对于植物的生长有较大的影响[25]，若能选择合适的、具有良好耐酸性、耐碱性的根瘤菌接种到植物上，对于提高植物的生长量和品质有较大的意义。在本实验中，设置了一系列pH，为4、5、6、7、8、9、10、11、12九个梯度。发现三株菌对于pH的耐受性范围较广，在pH值为6~11时均有菌株可以生长，并且在pH为6~9时生长情况最好。但是，三株菌对酸性环境的抗性都较差，在pH为4时，几乎无法生长。在pH为5时，也仅有极少量的生长。但是在偏酸、中性、偏碱、碱性的环境中仍有较好的生长能力。其中33号菌株在pH值为11时，其生长状况明显好于17，19号菌株，说明33号菌株对于碱性环境的耐受能力更强。具体情况见图2-6。 图2-6.不同pH下根瘤菌的生长 Fig2-6.The growth of the rhizobia strains in different pH2.5.3 根瘤菌对抗生素抗性、染料抗性实验 根瘤菌对抗生素的抗性、染料的抗性研究，都是对于根瘤菌理化性质的基础研究。研究发现三株菌对于卡那霉素的抗性都较差，在卡那霉素的浓度为50 μg/mL时，19号菌株就无法生长。当其浓度上升为100 μg/mL时，三株菌均无法生长。但是它们对于氨苄青霉素的抗性都比较好，17号菌株甚至在浓度为300 μg/mL的氨苄青霉素培养基上仍有少量生长。三株菌实验结果显示对于300 μg/mL的氯霉素均无抗性。三株菌在结晶紫上均无法生长，耐性较差。对于溴麝香草酚蓝的耐性有一定差异。总体来看，17号菌株的抗逆能力更强。具体情况见下表。 表2-2 根瘤菌对抗生素及染料抗性Table 2-2 The resistance of the rhizobia strains to antibiotic and dye菌株strain 氯霉素浓度（μg/mL）Concentration of chloramphenicol卡那霉素浓度 （μg/mL）Concentration of kanamycin氨苄青霉素浓度（μg/mL）Concentration ofperbritin溴百里香草粉蓝BTB结晶紫Crystal violet55010030055010055010030017＋＋＋－＋＋－＋＋＋＋＋－19＋＋＋－＋－－＋＋＋－－－33＋＋＋－＋＋－＋＋＋－＋－注：有菌生长记为“+”，不生长记为“-”2.5.4 根瘤菌的其他理化性质对于菌株的理化性质的分析研究是研究探讨一种菌株有特异性表现的原因的基础。如：淀粉水解实验，是判断所分离出的根瘤菌可否利用淀粉作为唯一碳源。经过实验，显示三株菌均无法利用淀粉作为唯一碳源。探究菌株是否产生过氧化氢酶是因为可以据此判断所筛选出的菌是好氧菌还是厌氧菌。因为过氧化氢酶能将过氧化氢分解为水和氧。一般厌氧细菌不能产生过氧化氢酶，而好氧细菌和某些兼性厌氧的细菌可以产生过氧化氢酶[26]。硝酸盐还原实验可以判断菌株是否具有硝酸盐还原能力；而甲基红实验则是判断菌株的代谢过程中是否会产酸。若产酸，则培养基会变红、为阳性反应，反之为黄色、为阴性反应。通过BTB产酸产碱反应可以初步推测根瘤菌是快生型根瘤菌还是慢生型根瘤菌。通常情况下，产酸为快生型根瘤菌，产碱为慢生型根瘤菌[27]。研究根瘤菌的理化性质对于分析其代谢途径、研究其抗性产生原因有着较为重要的意义。本研究中所探究的三株菌淀粉水解能力为阴性，过氧化氢酶解为阳性说明三株菌均无淀粉水解能力，非厌氧菌。此外，三株菌具有硝酸盐还原能力，产碱，甲基红实验结果显示为阴性。 图2-7. BTB 实验 图2-8.硝酸盐还原能力实验 Fig.2-7 BTB Test Fig.2-8 Nitrate reduction test 注：从左起依次为CK（不加BTB）；不接菌；接17号菌； 注：从左起依次为17号菌；19号菌；33号菌 接19号菌；接33号菌具体实验结果，如下表所示。 表2-3 根瘤菌其他生理生化特征 Table2-3 Physiological Biochemical Characteristics of the rhizobia strains菌株strain淀粉水解Amylum Hydrolysis 过氧化氢酶Catalase Test硝酸盐还原能力Nitrate reduction test甲基红实验M.R TestBTB实验BTB Test17－＋＋－产碱19－＋＋－产碱33－＋＋－产碱 注：阳性反应记为“+”；阴性反应记为“-”3.结论与讨论3.1讨论 所用菌株是从在重金属胁迫条件下生长的苜蓿上分离的。因而根瘤菌、苜蓿及其共生体系对于重金属都会有一定的抗性。但是，我国境内有多种豆科植物，我们需要找出与多种豆科植物均能产生良好共生固氮效果的菌株，为修复重金属污染地、改良土壤结构提供参考。为此，能够获取抗逆性较好的根瘤菌是前提，同时也要寻找具有良好抗逆性的共生组合，这是本研究的意义所在。本研究最终筛选出了三株抗逆性较好的根瘤菌，这为后续的实验提供了前提。但是，在研究过程中，对于所筛选、使用的三株根瘤菌未能确定其具体属于哪一种属，因此仍需通过对筛选出来的根瘤菌测序、绘制进化树来分析探究，以确定其具体的属、种。同时，在研究抗逆性时，有的胁迫条件下没有能够连续多测试几代，所以实验结果可能与实际存在一定的差异。本研究中发现的具有较好抗逆性的菌株，对于其是否能够通过回接到苜蓿上而发生结瘤现象仍是未知的。为此，仍需进行这几株根瘤菌与苜蓿的回接实验。同时，还需要探明这几株根瘤菌是否能与其他豆科植物共生结瘤，这也是仍然需要继续探究的一个方面。3.2结论 本研究中，通过对于重金属耐性菌株的筛选，选出了作为研究目标的3株菌，为根瘤菌17，19，33。三株菌均显示出对于重金属铜和镉有一定的耐受能力。三株菌均具有分泌IAA的能力，但是均无分泌铁载体的能力。在耐盐性方面，17号菌株的耐受范围为0~50 g/L，19、33号菌株的耐受范围为0~40 g/L。在探究三株菌对于酸碱度的耐受性方面，三株菌均表现为对于酸性生长环境无耐受性。但是，在pH为 6~9时，都能较好生长。在对其他一些生理生化特性进行研究时，三株菌的反应是相类似的。都不能把淀粉作为唯一碳源，都不是厌氧菌，并且都具有硝酸盐还原能力，这些与根瘤菌的普遍性质一样。在BTB产酸产碱反应中均表现为产碱，三株菌可能为慢生型根瘤菌。三株菌均可以用作后续研究的实验材料。致谢 张 敏 2015年5月6日参考文献[ 1 ] Ryan JA,Pahren HR,Lucas JB. 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目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1. 实验材料与方法 3
1.1 实验仪器 3
1.2 实验材料和试剂 3
1.3 实验方法 4
1.3.1 革兰氏染色实验 4
1.3.2 根瘤菌的抗重金属实验 4
1.3.3 根瘤菌产IAA、铁载体能力实验 4
1.3.4 根瘤菌的DNA提取、PCR扩增 4
1.3.5 根瘤菌生理生化实验 5
1.3.5.1 根瘤菌生长耐盐性实验 5
1.3.5.2 根瘤菌生长适宜pH的实验 5
1.3.5.3 根瘤菌对抗生素抗性实验 5
1.3.5.4 根瘤菌对染料的抗性实验 5
1.3.5.5 根瘤菌的淀粉水解实验 6
1.3.5.6根瘤菌的过氧化氢酶解实验 6
1.3.5.7 根瘤菌的硝酸盐还原实验 6
1.3.5.8 根瘤菌的BTB反应实验 6
1.3.5.9 根瘤菌的M.R实验 6
2. 结果与分析 6
2.1 根瘤菌的革兰氏染色实验 6
2.2 根瘤菌对重金属的抗性 6
2.3 根瘤菌产IAA、铁载体的能力 7
2.4 根瘤菌的16s rDNA PCR结果 8
2.5 根瘤菌的生理生化性质 8
2.5.1 根瘤菌生长耐盐性实验结果 8
2.5.2 根瘤菌生长适宜pH的实验结果 9
2.5.3 根瘤菌对抗生素、染料抗性实验结果 10
2.5.4 根瘤菌其他生物学特性实验结果 10
3. 结论与讨论 11
3.1讨论 11
3.2结论 11
致 谢 12
参考文献 12
耐重金属苜蓿根瘤菌的分离筛选及其生物学特性
引言
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