荞麦FtMATE和FtFRDL2的耐铝毒功能研究
荞麦FtMATE和FtFRDL2的耐铝毒功能研究[20200614171520]
摘要：镉是毒性最大的重金属元素之一，且可在土壤中存在较长的时间，对动物和人产生毒害作用。普通白菜(不结球白菜) (Brassica chinensis十字花科芸苔属芸苔种小白菜亚种)又称小白菜、青菜，原产我国，为长江流域普遍栽培的一种大众化蔬菜。植物镉积累能力不同主要是由吸收和转运引起的。P型ATP酶是与镉转运相关的蛋白之一，其中参与重金属离子转运的主要是重金属ATP酶(HMA)亚族。拟南芥中的AtHMA3和水稻中的OsHMA3参与将镉转运至液泡中的存储过程。本实验通过克隆BrHMA3启动子序列，比较控制不同小白菜品种镉吸收与积累基因启动子区域差异，构建启动子融合GUS报告基因表达载体，在拟南芥异源体系中表达，比较不同小白菜品种镉吸收与积累关键基因启动子表达差异。目前我已经构建了PS1aG-3 -Pro::GUS表达载体，对不同品种小白菜的序列进行比对，同时检测BrHMA3基因在不同品种中的拷贝数，发现地上部低镉积累品种中BrHMA3基因的拷贝数比地上部高镉积累品种高出5倍左右。当前，对小白菜吸收、积累镉的分子调控机制研究还处于空白。因此，阐明控制不同小白菜品种镉吸收、转运与积累差异的关键基因及其表达调控模式将为选育可食部位低积累镉的蔬菜新品种的分子辅助育种提供重要的分子基础与技术支持。
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关键字:BrHMA3；重金属转运；农杆菌转化；GUS
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Keywords 1
引言 2
1 材料与方法 2
1.1 材料2
1．2 不同品种小白菜基因组DNA提取2
1．3 不同品种小白菜HMA3基因启动子的克隆与序列分析2
1．4 四个小白菜品种 BrHMA 启动子融合GUS报告基因的表达载体构建3
1.5四个品种BrHMA3基因启动子在拟南芥中活性分析3
1.5.1农杆菌感受态制备及转化3
1.5.2拟南芥转基因4
1．6植物生长条件4
1.7转基因植株鉴定4
2 结果分析 4
2.1 不同品种小白菜HMA3基因启动子的克隆与序列分析4
2．1．1 不同品种小白菜BrHMA3基因启动子的获得4
2．1．2 不同品种小白菜BrHMA3基因启动子序列分析5
2.2 获得启动子-GUS表达载体5
2.3转基因株系的获得与鉴定6
2.4四个品种小白菜BrHMA3基因拷贝数比较7
3 讨论7
致谢8
参考文献8
小白菜吸收、积累镉的分子调控机制研究
国家生命科学与技术人才培养基地
张凌霄 10110206
引言
镉（Cd）作为一种有害重金属，是主要的环境污染物之一。土壤中的Cd可严重影响土壤生物系统，包括土壤中的酶以及土壤中的物质于植物之间的相互作用[1,2]。Cd可被植物吸收进入食物链，严重威胁人类健康[3]。由于工业化和城镇化的快速发展，加之化学肥料的大 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
量施用，我国农田土壤Cd污染日趋严重[4]。
镉在植物体内的累积有很大的差异，不同的植物对镉的策略也不一致，有的采取富集策略也有的采用排斥策略。普通白菜(不结球白菜) ( Brassica chinensis)又称小白菜、青菜，属于十字花科芸苔属芸苔种小白菜亚种，原产我国，为长江流域普遍培植的一种大众化蔬菜，北方亦栽培，品种众多，在蔬菜供应中占有重要地位。十字花科植物如白菜对镉的积累能力较强，是食物中镉的重要来源之一。不同小白菜品种间对镉的吸收与累积有显著的差异性[5]。植物镉积累能力不同主要是由于镉在植物体内的吸收和转运引起的。
与重金属转运相关的基因和蛋白质一直是植物重金属累积机理研究的一大热点，与镉转运相关的蛋白有很多，如ABC转运蛋白家族、P-type ATPase、ZIP家族蛋白、NRAMP家族转运体和阳离子反向运输体等。P型ATP酶中参与重金属离子转运的主要是重金属ATP酶(HMA)亚族，其中已被证实与镉吸收转运相关的HMA基因有HMA3、HMA4、HMA9 等。
拟南芥AtHMA3定位于液泡膜，在保卫细胞水腺、维管组织和根尖等组织中具有较高表达水平，AtHMA3基因能转运镉、铅、钴、锌等，研究认为AtHMA3参与将镉转运至液泡中的存储过程[6]。若将拟南芥外源基因AtHMA3转入至酵母中，HMA3基因的表达可有效提高酵母敏感菌株对Cd的耐受性[7]。水稻低镉品种的OsHMA3能将镉限制在根液泡中而使其不能向地上部转运，从而减少镉向地上组织的转移量[8]。在一些水稻品种中OsHMA3可作为应答基因，其蛋白功能缺失可导致Cd 在水稻地上部的高度积累[9]。AtHMA4定位于根维管系统周围组织的质膜中，介导Cd、Zn等通过木质部向茎尖的转运[10]。与OsHMA3、OsHMA4 等的功能不同的是，OsHMA9 能够将细胞内的Cu、Zn、Pb、Cd等重金属外排至胞外，是单子叶植物中发现的第一个属于HMA基因亚族的金属外排转运体[11]。
课题组前期的研究对十个品种小白菜进行了镉积累能力的比较，筛选得到两个地上部高镉积累品种：津绿75、大青麻叶939和两个地上部低镉积累品种：高脚匙羹白、Z16。并且发现津绿75、大青麻叶939这两个品种中BrHMA3基因的表达很少，而高脚匙羹白、Z16这两个品种中BrHMA3基因的表达相对较高。本课题希望通过对这四个品种的BrHMA3 基因的启动子序列分析和基因拷贝数分析，阐明小白菜吸收、积累镉的分子调控机制。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 载体PS1aG-3; pMD19
1．1．2 拟南芥材料 野生型Columbia（Col-0）；十个品种小白菜
1．2 不同品种小白菜基因组DNA提取
选择10个小白菜品种：高脚匙羹白、Z16、Br1WFhnP2、津绿75、Chiifu、大青麻叶、L58、R-O-18、L143和CGN15199进行水培。用1/2 Hogland营养液培养15天左右，采集各品种白菜叶片0.1 g左右，采用CTAB法提取基因组DNA。
1．3 不同品种小白菜HMA3基因启动子的克隆与序列分析
通过小白菜基因组数据库Brassica Database(http://brassicadb. *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
org)获得BrHMA3基因ATG上游DNA序列，设计引物以基因组DNA为模板扩增BrHMA3基因上游1000 bp左右序列，引物序列为：
F：5’- GTCCCATGCTTATAGGGGAGGG-3’；
R：5’- CGTTGGATACGCGAAAGGTGTT-3’。
对扩增得到的片段进行纯化后克隆至pEASY-Blunt 载体后进行测序，对测序后的序列进行比对分析。
1．4 四个小白菜品种 BrHMA 启动子融合GUS报告基因的表达载体构建
PS1aG-3 -Pro::GUS的构建采用ClonExpress快速克隆技术。用于拟南芥基因转化的载体为PS1aG-3, Ps1aG-3表达载体含有GUS的报告基因，同时具有壮观酶素和潮霉素的抗性筛选基因Spec和HptII。根据PS1aG-3载体序列，设计带有重组臂的启动子重组引物：F：5’ -TTATGCATGCGGCCGCTTAATTAAGTCCCATGCTTATAGGGGAGGG-3’，
R：5’-AGGCGGACCTTTGCACGGCGCGCCCGTTGGATACGCGAAAGGTGTT-3’，扩增四个品种小白菜HMA3启动子片段，片段纯化后与线性化的PS1aG-3载体进行重组反应，反应结束后将重组产物转化至大肠杆菌Trans1-T1，而后在Spec抗性LB平板上进行筛选，菌落PCR挑选重组克隆，最终测序验证。具体试验流程如下图：
1.5.2 拟南芥转基因
以抽苔开花的野生型拟南芥为材料，用农杆菌介导的方法[12]进行转基因操作。其基本的操作过程：培养健康的拟南芥直到开始抽苔并开花；农杆菌（工程菌 EHA105）菌液培养；构建好的载体通过热击转化导入农杆菌，将携带有载体的菌液培养至OD=1.0左右，加入0.02%（vol/vol）的Silwet L-77 并立即混匀准备侵染；将植株的花序部分在农杆菌悬浮液中侵染10s，将侵染完的植株在高湿度环境下共培养16~24小时。之后再正常生长一个月，收获种子。将转基因拟南芥种子发苗后进行阳性苗筛选与鉴定。
摘要：镉是毒性最大的重金属元素之一，且可在土壤中存在较长的时间，对动物和人产生毒害作用。普通白菜(不结球白菜) (Brassica chinensis十字花科芸苔属芸苔种小白菜亚种)又称小白菜、青菜，原产我国，为长江流域普遍栽培的一种大众化蔬菜。植物镉积累能力不同主要是由吸收和转运引起的。P型ATP酶是与镉转运相关的蛋白之一，其中参与重金属离子转运的主要是重金属ATP酶(HMA)亚族。拟南芥中的AtHMA3和水稻中的OsHMA3参与将镉转运至液泡中的存储过程。本实验通过克隆BrHMA3启动子序列，比较控制不同小白菜品种镉吸收与积累基因启动子区域差异，构建启动子融合GUS报告基因表达载体，在拟南芥异源体系中表达，比较不同小白菜品种镉吸收与积累关键基因启动子表达差异。目前我已经构建了PS1aG-3 -Pro::GUS表达载体，对不同品种小白菜的序列进行比对，同时检测BrHMA3基因在不同品种中的拷贝数，发现地上部低镉积累品种中BrHMA3基因的拷贝数比地上部高镉积累品种高出5倍左右。当前，对小白菜吸收、积累镉的分子调控机制研究还处于空白。因此，阐明控制不同小白菜品种镉吸收、转运与积累差异的关键基因及其表达调控模式将为选育可食部位低积累镉的蔬菜新品种的分子辅助育种提供重要的分子基础与技术支持。
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关键字:BrHMA3；重金属转运；农杆菌转化；GUS
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摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Keywords 1
引言 2
1 材料与方法 2
1.1 材料2
1．2 不同品种小白菜基因组DNA提取2
1．3 不同品种小白菜HMA3基因启动子的克隆与序列分析2
1．4 四个小白菜品种 BrHMA 启动子融合GUS报告基因的表达载体构建3
1.5四个品种BrHMA3基因启动子在拟南芥中活性分析3
1.5.1农杆菌感受态制备及转化3
1.5.2拟南芥转基因4
1．6植物生长条件4
1.7转基因植株鉴定4
2 结果分析 4
2.1 不同品种小白菜HMA3基因启动子的克隆与序列分析4
2．1．1 不同品种小白菜BrHMA3基因启动子的获得4
2．1．2 不同品种小白菜BrHMA3基因启动子序列分析5
2.2 获得启动子-GUS表达载体5
2.3转基因株系的获得与鉴定6
2.4四个品种小白菜BrHMA3基因拷贝数比较7
3 讨论7
致谢8
参考文献8
小白菜吸收、积累镉的分子调控机制研究
国家生命科学与技术人才培养基地
张凌霄 10110206
引言
镉（Cd）作为一种有害重金属，是主要的环境污染物之一。土壤中的Cd可严重影响土壤生物系统，包括土壤中的酶以及土壤中的物质于植物之间的相互作用[1,2]。Cd可被植物吸收进入食物链，严重威胁人类健康[3]。由于工业化和城镇化的快速发展，加之化学肥料的大 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
量施用，我国农田土壤Cd污染日趋严重[4]。
镉在植物体内的累积有很大的差异，不同的植物对镉的策略也不一致，有的采取富集策略也有的采用排斥策略。普通白菜(不结球白菜) ( Brassica chinensis)又称小白菜、青菜，属于十字花科芸苔属芸苔种小白菜亚种，原产我国，为长江流域普遍培植的一种大众化蔬菜，北方亦栽培，品种众多，在蔬菜供应中占有重要地位。十字花科植物如白菜对镉的积累能力较强，是食物中镉的重要来源之一。不同小白菜品种间对镉的吸收与累积有显著的差异性[5]。植物镉积累能力不同主要是由于镉在植物体内的吸收和转运引起的。
与重金属转运相关的基因和蛋白质一直是植物重金属累积机理研究的一大热点，与镉转运相关的蛋白有很多，如ABC转运蛋白家族、P-type ATPase、ZIP家族蛋白、NRAMP家族转运体和阳离子反向运输体等。P型ATP酶中参与重金属离子转运的主要是重金属ATP酶(HMA)亚族，其中已被证实与镉吸收转运相关的HMA基因有HMA3、HMA4、HMA9 等。
拟南芥AtHMA3定位于液泡膜，在保卫细胞水腺、维管组织和根尖等组织中具有较高表达水平，AtHMA3基因能转运镉、铅、钴、锌等，研究认为AtHMA3参与将镉转运至液泡中的存储过程[6]。若将拟南芥外源基因AtHMA3转入至酵母中，HMA3基因的表达可有效提高酵母敏感菌株对Cd的耐受性[7]。水稻低镉品种的OsHMA3能将镉限制在根液泡中而使其不能向地上部转运，从而减少镉向地上组织的转移量[8]。在一些水稻品种中OsHMA3可作为应答基因，其蛋白功能缺失可导致Cd 在水稻地上部的高度积累[9]。AtHMA4定位于根维管系统周围组织的质膜中，介导Cd、Zn等通过木质部向茎尖的转运[10]。与OsHMA3、OsHMA4 等的功能不同的是，OsHMA9 能够将细胞内的Cu、Zn、Pb、Cd等重金属外排至胞外，是单子叶植物中发现的第一个属于HMA基因亚族的金属外排转运体[11]。
课题组前期的研究对十个品种小白菜进行了镉积累能力的比较，筛选得到两个地上部高镉积累品种：津绿75、大青麻叶939和两个地上部低镉积累品种：高脚匙羹白、Z16。并且发现津绿75、大青麻叶939这两个品种中BrHMA3基因的表达很少，而高脚匙羹白、Z16这两个品种中BrHMA3基因的表达相对较高。本课题希望通过对这四个品种的BrHMA3 基因的启动子序列分析和基因拷贝数分析，阐明小白菜吸收、积累镉的分子调控机制。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 载体PS1aG-3; pMD19
1．1．2 拟南芥材料 野生型Columbia（Col-0）；十个品种小白菜
1．2 不同品种小白菜基因组DNA提取
选择10个小白菜品种：高脚匙羹白、Z16、Br1WFhnP2、津绿75、Chiifu、大青麻叶、L58、R-O-18、L143和CGN15199进行水培。用1/2 Hogland营养液培养15天左右，采集各品种白菜叶片0.1 g左右，采用CTAB法提取基因组DNA。
1．3 不同品种小白菜HMA3基因启动子的克隆与序列分析
通过小白菜基因组数据库Brassica Database(http://brassicadb. *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
org)获得BrHMA3基因ATG上游DNA序列，设计引物以基因组DNA为模板扩增BrHMA3基因上游1000 bp左右序列，引物序列为：
F：5’- GTCCCATGCTTATAGGGGAGGG-3’；
R：5’- CGTTGGATACGCGAAAGGTGTT-3’。
对扩增得到的片段进行纯化后克隆至pEASY-Blunt 载体后进行测序，对测序后的序列进行比对分析。
1．4 四个小白菜品种 BrHMA 启动子融合GUS报告基因的表达载体构建
PS1aG-3 -Pro::GUS的构建采用ClonExpress快速克隆技术。用于拟南芥基因转化的载体为PS1aG-3, Ps1aG-3表达载体含有GUS的报告基因，同时具有壮观酶素和潮霉素的抗性筛选基因Spec和HptII。根据PS1aG-3载体序列，设计带有重组臂的启动子重组引物：F：5’ -TTATGCATGCGGCCGCTTAATTAAGTCCCATGCTTATAGGGGAGGG-3’，
R：5’-AGGCGGACCTTTGCACGGCGCGCCCGTTGGATACGCGAAAGGTGTT-3’，扩增四个品种小白菜HMA3启动子片段，片段纯化后与线性化的PS1aG-3载体进行重组反应，反应结束后将重组产物转化至大肠杆菌Trans1-T1，而后在Spec抗性LB平板上进行筛选，菌落PCR挑选重组克隆，最终测序验证。具体试验流程如下图：
1.5.2 拟南芥转基因
以抽苔开花的野生型拟南芥为材料，用农杆菌介导的方法[12]进行转基因操作。其基本的操作过程：培养健康的拟南芥直到开始抽苔并开花；农杆菌（工程菌 EHA105）菌液培养；构建好的载体通过热击转化导入农杆菌，将携带有载体的菌液培养至OD=1.0左右，加入0.02%（vol/vol）的Silwet L-77 并立即混匀准备侵染；将植株的花序部分在农杆菌悬浮液中侵染10s，将侵染完的植株在高湿度环境下共培养16~24小时。之后再正常生长一个月，收获种子。将转基因拟南芥种子发苗后进行阳性苗筛选与鉴定。
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