外生菌根真菌对重金属Cd耐性的研究
外生菌根真菌对重金属Cd耐性的研究[20200614171423]
摘要：本实验以抗草丁膦甘蓝型油菜（Brassica napus，2n=38=AACC）和野芥菜wild B. Juncea（2n=36=AABB)回交所得的抗草丁膦回交1代子3代（BC1F4）、回交2代子2代（BC2F3）、回交3代子1代（BC3F2）为研究对象，对其在温室条件下各项适合度指标进行测量、比较，包括营养生长期指标（株高、茎粗、莲座状直径、一次分枝数、地上部生物量）和生殖生长期指标（单株有效角果数、角果长、每角果饱粒数）。并对抗草丁膦回交1代子3代、回交2代子2代、回交3代子1代的自交后代进行抗性筛选和鉴定，了解其在温室条件下后代的抗性分离情况。结果表明通过不断的回交、自交，供试后代的总适合度除正向回交3代子1代的显著高于野芥菜外，其它后代都与野芥菜相当。供试回交后代大多数适合度指标都恢复到轮回亲本野芥菜的水平，但生殖生长期指标的每角饱粒数在回交1代子3代以及回交2代子2代中仍然显著低于野芥菜。从抗性分离情况来看，在草丁膦选择压下，实验数据表明，自交后代的抗性分离比显著偏离孟德尔遗传，但抗性基因能够得到较好的保存，并较高频率地传递给自交后代。上述结果表明，供试回交后代超高的适合度意味着在自然条件下，它们有自行完成生活史，并建立种群的的潜在可能性，因此可能引起的生态风险不容忽视。
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关键字:抗草丁膦转基因油菜；野芥菜；回交后代；适合度
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言（或绪论）3
1材料与方法4
1.1材料 4
1.2方法 4
1.2.1材料种植4
1.2.2抗性筛选4
1.2.3抗性检测4
1.2.4 适合度成分的测定4
1.2.6 数据的统计与分析5
2 结果与分析5
2.1抗草丁膦回交后代的温室适合度表现和总适合度比较5
2.1.1株高 5
2.1.2茎粗 6
2.1.3一次分枝数 6
2.1.4莲座直径 7
2.1.5地上部生物量 7
2.1.6有效角果数 8
2.1.7角果长 8
2.1.8每角饱粒数 9
2.1.9总适合度 9
2.2抗性筛选的分离比例 10
2.3抗性鉴定 15
3讨论 15
致谢16
参考文献16
抗草丁膦转基因油菜和野芥菜BC1F4, BC2F3 and BC3F2的温室适合度
引言
引言
随着转基因作物的大量种植，其抗性基因向野生近缘种的渗入也越来越受到人们的关注[1]。基因渗入就是一个物种通过杂交和连续回交对另一物种进行的基因修饰[2]。抗除草剂转基因油菜（Brassica napus，2n=38=AACC）已经在生产中广泛应用，因此，关于基因能否渗入其近缘杂草中已经有大量试验报道[3-4]。基因渗入是一个复杂的过程，其成功与否受很多方面的影响，特别是（1）转基因在杂交 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
和回交后代中的持续传递能力；（2）后代染色体的重组、整合和遗传的稳定性；（3）携带转基因的后代在自然环境中的生存、定植能力[5-9]。
转基因作物中的抗性基因能否稳定渗入近缘种并长期保持十分关键，稳定的遗传会让杂种在相应选择压下表现出优势，造成严重的生态威胁。孟德尔遗传规律是最基本的遗传规律，在多数转基因杂交、回交试验中也同样适用。然而，在转基因油菜和野萝卜(Raphanus raphanistrum)组成的回交后代中，出现了染色体结构的不稳定，抗性遗传率小的现象[10]。在转基因油菜和芜菁(B. rapa)的回交试验中发现，存在C染色体上的抗性基因以较低频率被传递[11]。因此，研究抗性基因在杂交后代以及回交后代中的遗传规律十分重要。
适合度是评价携带抗性转基因的杂交或回交后代能否成功在自然界中生存定植的重要因素，尤其是其连续回交后代的适合度[12]。低的适合度严重影响杂种的定植、生存，使得转基因无法继续传递。作物基因的渗入能力也不尽相同，有的基因容易渗入，而有的基因因为与一些不利基因串联，导致具有低的适合度，则不易渗入[13]。比如渗入的基因中包含落粒性弱、易感病、无二次休眠等性状，可能会影响杂种在野外的生存能力[14]。将目的基因和一个经选择的不利基因串联，并导入受体，能够降低杂种的适合度[15]。在竞争环境下，包含越多杂草基因的后代，其产生的种子数量越多，适合度就越高[16]。除草剂的选择压也会对适合度产生影响，在有除草剂选择压的情况下，野萝卜和栽培萝卜的转基因杂种能产生更多的种子[17]。在有害虫情况下，抗虫基因的渗入能够提高杂种后代的生存能力[18]。虽然有适合度代价的存在，在有草甘膦雾滴漂移下，抗草甘膦转基因油菜和芜菁的杂种后代，其适合度反而有所提高[19]。也有报道也指出，即使是在无选择压的条件下，抗性基因也能在油菜和芜菁的杂种后代保留长达6年[3]。杂交后代的适合度在不同环境下可能具有很大的差异，因此深入了解各个杂交、回交后代在不同环境条件下的适合度很有必要性。
野芥菜(B. juncea var. Gracilis, 2n=36=AABB)为栽培油菜的自逸产物，被称为四大盖草之一，因能够覆盖在作物之上，开黄色的花，影响作物的生长发育而得名，严重危害小麦、青稞、油菜等作物[20]，而且有的种群已经获得了草甘膦抗性[21]。可见，基因漂移不只是理论上的假设，在实际生产中，抗性基因的漂移已经得到了证实。如果转基因油菜的抗性基因能渗入到野芥菜中，将会给该种杂草的防除带来新的难题。
甘蓝型油菜（2n=38=AACC）和野芥菜（2n=38=AACC）在基因组构成上均为异源四倍体，且共用同一A染色体，使得它们在田间有较好的亲和性[22-24]。并且有研究表明杂交后代具有较好的适应性[23]，抗性基因在回交一代中能够保持较高的继承能力[24]。虽然我国已经开展了抗性基因漂移的研究，证明了抗性基因能够从转基因油菜中流向野芥菜，形成F1[25-26]。但转基因油菜和野芥菜后代适合度的研究只局限在F1、F2和回交1代[26-27]，对于连续多世代合适度的跟踪调查相对缺乏，可用于环境生物安全评价的十分少，因此必须对杂种合适度进行连续、长期的跟踪调查[28]。本试验以抗曹丁膦转基因油菜和野芥菜的正反回交1代子4代、回交2代子2代以及回交3代子1代为研究对象，考察这些回交后代在温 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
室条件下的生存适合度，并详细研究抗性基因在这些回交后代自交产生的自子代中的传递规律，希望为转基因油菜安全性评估提供更深入的试验依据。
1、材料与方法
1.1 实验材料
野芥菜(B. juncea var. gracilis)，采集于南京江浦，抗草丁膦转基因油菜(Swallow，Liberty Link，event HCN92)来自加拿大，纯合、含有2个拷贝的（连锁）的pat基因。通过杂交、回交获得抗草丁膦转基因油菜和野芥菜的回交1代子3代、回交2代子2代、回交3代子1代。
表1 本实验所用抗草丁膦回交后代
抗草丁膦回交后代
正向回交 反向回交
回交1代子3代（BC1mF4） 回交1代子3代（BC1pF4）
回交2代子2代（BC2mF3） 回交2代子2代（BC2pF3）
回交3代子1代（BC3mF2） 回交3代子1代（BC3pF2）
1.2 实验方法
1.2.1 材料种植
实验在大学牌楼玻璃温室中进行。从经过抗性筛选和抗性检测后存活下来的植株中挑选出生长健壮、大小适中的植株，按照实验设计进行盆钵移栽。盆钵中所用土壤为菜园土，与腐殖质按1:1比例混合均匀。所用盆钵口径23cm，深24cm。每盆移栽一株。抗性油菜、野芥菜各移栽20株，每种后代各移栽60株。开花期对各植株进行套袋处理，避免其窜粉，成熟后整株收获、考种，并收取种子。
1.2.2 抗性筛选
种植BC1F4、BC2F3、BC3F2种子，容器为底部打孔的一次性塑料小杯（口径6.5cm，深度9cm），基质为没有野芥菜发生的菜园土，浇足水，每杯播种1粒，浅盖土。在温室中进行正常的栽培管理。15d后统计出苗率。待植株长至4叶期时用20%的草丁膦（保试达，拜耳公司生产，德国）（1500ppm）选2次，施药剂量为700 g（a.i.）/ha。采用手持式喷雾器（黄岩市下喷雾器有限公司，浙江，中国），扇形喷头。施用时选择野芥菜和相应的转基因油菜各30株作为阴阳对照。待产生明显药害时统计死亡率以及存活植株数量，并对存活植株抽样进行分子检测，检测抗性基因的存在。
摘要：本实验以抗草丁膦甘蓝型油菜（Brassica napus，2n=38=AACC）和野芥菜wild B. Juncea（2n=36=AABB)回交所得的抗草丁膦回交1代子3代（BC1F4）、回交2代子2代（BC2F3）、回交3代子1代（BC3F2）为研究对象，对其在温室条件下各项适合度指标进行测量、比较，包括营养生长期指标（株高、茎粗、莲座状直径、一次分枝数、地上部生物量）和生殖生长期指标（单株有效角果数、角果长、每角果饱粒数）。并对抗草丁膦回交1代子3代、回交2代子2代、回交3代子1代的自交后代进行抗性筛选和鉴定，了解其在温室条件下后代的抗性分离情况。结果表明通过不断的回交、自交，供试后代的总适合度除正向回交3代子1代的显著高于野芥菜外，其它后代都与野芥菜相当。供试回交后代大多数适合度指标都恢复到轮回亲本野芥菜的水平，但生殖生长期指标的每角饱粒数在回交1代子3代以及回交2代子2代中仍然显著低于野芥菜。从抗性分离情况来看，在草丁膦选择压下，实验数据表明，自交后代的抗性分离比显著偏离孟德尔遗传，但抗性基因能够得到较好的保存，并较高频率地传递给自交后代。上述结果表明，供试回交后代超高的适合度意味着在自然条件下，它们有自行完成生活史，并建立种群的的潜在可能性，因此可能引起的生态风险不容忽视。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
关键字:抗草丁膦转基因油菜；野芥菜；回交后代；适合度
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言（或绪论）3
1材料与方法4
1.1材料 4
1.2方法 4
1.2.1材料种植4
1.2.2抗性筛选4
1.2.3抗性检测4
1.2.4 适合度成分的测定4
1.2.6 数据的统计与分析5
2 结果与分析5
2.1抗草丁膦回交后代的温室适合度表现和总适合度比较5
2.1.1株高 5
2.1.2茎粗 6
2.1.3一次分枝数 6
2.1.4莲座直径 7
2.1.5地上部生物量 7
2.1.6有效角果数 8
2.1.7角果长 8
2.1.8每角饱粒数 9
2.1.9总适合度 9
2.2抗性筛选的分离比例 10
2.3抗性鉴定 15
3讨论 15
致谢16
参考文献16
抗草丁膦转基因油菜和野芥菜BC1F4, BC2F3 and BC3F2的温室适合度
引言
引言
随着转基因作物的大量种植，其抗性基因向野生近缘种的渗入也越来越受到人们的关注[1]。基因渗入就是一个物种通过杂交和连续回交对另一物种进行的基因修饰[2]。抗除草剂转基因油菜（Brassica napus，2n=38=AACC）已经在生产中广泛应用，因此，关于基因能否渗入其近缘杂草中已经有大量试验报道[3-4]。基因渗入是一个复杂的过程，其成功与否受很多方面的影响，特别是（1）转基因在杂交 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
和回交后代中的持续传递能力；（2）后代染色体的重组、整合和遗传的稳定性；（3）携带转基因的后代在自然环境中的生存、定植能力[5-9]。
转基因作物中的抗性基因能否稳定渗入近缘种并长期保持十分关键，稳定的遗传会让杂种在相应选择压下表现出优势，造成严重的生态威胁。孟德尔遗传规律是最基本的遗传规律，在多数转基因杂交、回交试验中也同样适用。然而，在转基因油菜和野萝卜(Raphanus raphanistrum)组成的回交后代中，出现了染色体结构的不稳定，抗性遗传率小的现象[10]。在转基因油菜和芜菁(B. rapa)的回交试验中发现，存在C染色体上的抗性基因以较低频率被传递[11]。因此，研究抗性基因在杂交后代以及回交后代中的遗传规律十分重要。
适合度是评价携带抗性转基因的杂交或回交后代能否成功在自然界中生存定植的重要因素，尤其是其连续回交后代的适合度[12]。低的适合度严重影响杂种的定植、生存，使得转基因无法继续传递。作物基因的渗入能力也不尽相同，有的基因容易渗入，而有的基因因为与一些不利基因串联，导致具有低的适合度，则不易渗入[13]。比如渗入的基因中包含落粒性弱、易感病、无二次休眠等性状，可能会影响杂种在野外的生存能力[14]。将目的基因和一个经选择的不利基因串联，并导入受体，能够降低杂种的适合度[15]。在竞争环境下，包含越多杂草基因的后代，其产生的种子数量越多，适合度就越高[16]。除草剂的选择压也会对适合度产生影响，在有除草剂选择压的情况下，野萝卜和栽培萝卜的转基因杂种能产生更多的种子[17]。在有害虫情况下，抗虫基因的渗入能够提高杂种后代的生存能力[18]。虽然有适合度代价的存在，在有草甘膦雾滴漂移下，抗草甘膦转基因油菜和芜菁的杂种后代，其适合度反而有所提高[19]。也有报道也指出，即使是在无选择压的条件下，抗性基因也能在油菜和芜菁的杂种后代保留长达6年[3]。杂交后代的适合度在不同环境下可能具有很大的差异，因此深入了解各个杂交、回交后代在不同环境条件下的适合度很有必要性。
野芥菜(B. juncea var. Gracilis, 2n=36=AABB)为栽培油菜的自逸产物，被称为四大盖草之一，因能够覆盖在作物之上，开黄色的花，影响作物的生长发育而得名，严重危害小麦、青稞、油菜等作物[20]，而且有的种群已经获得了草甘膦抗性[21]。可见，基因漂移不只是理论上的假设，在实际生产中，抗性基因的漂移已经得到了证实。如果转基因油菜的抗性基因能渗入到野芥菜中，将会给该种杂草的防除带来新的难题。
甘蓝型油菜（2n=38=AACC）和野芥菜（2n=38=AACC）在基因组构成上均为异源四倍体，且共用同一A染色体，使得它们在田间有较好的亲和性[22-24]。并且有研究表明杂交后代具有较好的适应性[23]，抗性基因在回交一代中能够保持较高的继承能力[24]。虽然我国已经开展了抗性基因漂移的研究，证明了抗性基因能够从转基因油菜中流向野芥菜，形成F1[25-26]。但转基因油菜和野芥菜后代适合度的研究只局限在F1、F2和回交1代[26-27]，对于连续多世代合适度的跟踪调查相对缺乏，可用于环境生物安全评价的十分少，因此必须对杂种合适度进行连续、长期的跟踪调查[28]。本试验以抗曹丁膦转基因油菜和野芥菜的正反回交1代子4代、回交2代子2代以及回交3代子1代为研究对象，考察这些回交后代在温 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
室条件下的生存适合度，并详细研究抗性基因在这些回交后代自交产生的自子代中的传递规律，希望为转基因油菜安全性评估提供更深入的试验依据。
1、材料与方法
1.1 实验材料
野芥菜(B. juncea var. gracilis)，采集于南京江浦，抗草丁膦转基因油菜(Swallow，Liberty Link，event HCN92)来自加拿大，纯合、含有2个拷贝的（连锁）的pat基因。通过杂交、回交获得抗草丁膦转基因油菜和野芥菜的回交1代子3代、回交2代子2代、回交3代子1代。
表1 本实验所用抗草丁膦回交后代
抗草丁膦回交后代
正向回交 反向回交
回交1代子3代（BC1mF4） 回交1代子3代（BC1pF4）
回交2代子2代（BC2mF3） 回交2代子2代（BC2pF3）
回交3代子1代（BC3mF2） 回交3代子1代（BC3pF2）
1.2 实验方法
1.2.1 材料种植
实验在大学牌楼玻璃温室中进行。从经过抗性筛选和抗性检测后存活下来的植株中挑选出生长健壮、大小适中的植株，按照实验设计进行盆钵移栽。盆钵中所用土壤为菜园土，与腐殖质按1:1比例混合均匀。所用盆钵口径23cm，深24cm。每盆移栽一株。抗性油菜、野芥菜各移栽20株，每种后代各移栽60株。开花期对各植株进行套袋处理，避免其窜粉，成熟后整株收获、考种，并收取种子。
1.2.2 抗性筛选
种植BC1F4、BC2F3、BC3F2种子，容器为底部打孔的一次性塑料小杯（口径6.5cm，深度9cm），基质为没有野芥菜发生的菜园土，浇足水，每杯播种1粒，浅盖土。在温室中进行正常的栽培管理。15d后统计出苗率。待植株长至4叶期时用20%的草丁膦（保试达，拜耳公司生产，德国）（1500ppm）选2次，施药剂量为700 g（a.i.）/ha。采用手持式喷雾器（黄岩市下喷雾器有限公司，浙江，中国），扇形喷头。施用时选择野芥菜和相应的转基因油菜各30株作为阴阳对照。待产生明显药害时统计死亡率以及存活植株数量，并对存活植株抽样进行分子检测，检测抗性基因的存在。
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