苞卫抗性菌burkholderiasp.bk的分离鉴苞卫抗性菌burkholderiasp.bk的分离鉴定及其菌体抗性的研究(附件)【字数：6923】
【目的】从中山陵茶园的土壤样品中筛选对苞卫有抗性的菌株，并对抗性菌株进行分类地位和生物学特性的分析；通过自然驯化提高菌株对苞卫的抗性。【方法】采用富集培养的方法，在以酪氨酸为唯一碳源的培养基上筛选分离苞卫抗性菌株；使用16S rRNA 基因序列分析对菌株进行分类地位的鉴定；对菌株的细胞形态、生理特性以及菌体抗性进行表征；通过驯化的方式获得苞卫高抗性菌株。【结果】在苞卫浓度为600 mg/L的酪氨酸选择性培养基上，筛选到一株苞卫抗性细菌，经16S rRNA 鉴定该菌株为伯克氏菌属，将其命名为Burkholderia sp. BK；菌株BK为革兰氏阴性杆菌，最适培养的pH范围为4.0-7.0，最适培养温度为30 ℃；苞卫对菌株的生长具有抑制作用；第十七代驯化液的菌株BK-M17具有更高的菌体抗性。【结论】分离筛选到的菌株BK具有良好的苞卫抗性，其将对苞卫除草剂抗性作物的选育具有重大意义。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1 材料与方法 2
1．1 实验材料 2
1．1．1 样品 2
1．1．2 试剂 2
1．1．3 培养基 3
1．1．4 仪器设备 3
1．2 实验方法 3
1．2．1 抗性菌株的分离与筛选 3
1．2．2 分离菌株的抗性比较 3
1．2．3 抗性菌株分类地位的鉴定 3
1．2．3. 1 细菌总DNA的提取 3
1．2．3. 2 16S rRNA 基因序列的扩增 4
1．2．3. 3 系统发育分析 4
1．2．4 菌株BK的生物学特性分析 4
1．2．4. 1 细胞形态学分析 4
1．2．4.2 最适生长温度和pH实验 4
1．2．4.3 菌体的抗性强度 4
1．2．5 菌株BK的驯化 5
2 结果与分析 5
2．1 苞卫抗性菌株的分离与筛选 5
2．2 分离菌株的抗性比较 5
2． *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
3 抗性菌株分类地位的鉴定 5
2．4 菌株BK的生物学特性分析 6
2．4．1 细胞形态学分析 6
2．4．2 最适生长温度和pH实验 7
2．4．3 菌体的抗性强度 7
2．5 菌株BK的驯化 8
3 讨论 8
致谢 9
参考文献： 10
苞卫抗性菌Burkholderia sp. BK的分离、鉴定及其菌体抗性的研究
引言
引言
1苞卫除草剂的简介及其作用机理
苞卫是于2009年被巴斯夫（德国）有限公司推出的一种苯甲酯吡唑酮类除草剂[1]。该药具有除草效率高、对玉米生长安全等特点，对耐草甘膦（氨基酸类），三嗪类，磺酰脲类、芳氧苯氧丙酸类以及咪唑啉酮类除草剂的杂草有很好的防除效果，尤其对玉米田地中的一年生禾本科和阔叶杂草作用显著。相比于草甘膦等非选择性除草剂，该除草剂对作物特异性高，且性能优良，安全性高，因而在农业上应用广泛[2]。苞卫能够竞争性抑制对羟苯基丙酮酸双氧化酶（HPPD）的活性，使机体内质体醌和生育酚的生物合成过程受阻，进而抑制植物体内类胡萝卜素的合成，干扰叶绿体的生成和生理功能，使发芽的植物呈现白化症状[3]。
2对羟苯基丙酮酸双氧化酶（phydroxyphenylpyruvate dioxygenase, HPPD）
HPPD是继PPO和AHAS之后发现的又一重要的除草剂靶标，受三酮类、吡唑类和异噁唑类除草剂的竞争抑制作用。HPPD是一种含有二价铁的α酮酸依赖型的双加氧酶，几乎存在于所有需氧生物的体内。在生物体的L酪氨酸分解代谢中，酪氨酸首先在酪氨酸氨基转移酶的催化作用下转化为对羟苯基丙酮酸（HPP），HPP继续在HPPD的催化下氧化脱羧形成尿黑酸（HGA）；尿黑酸经过一系列酶的催化作用最终形成乙酰乙酸和延胡索酸进入三羧酸循环被生物体利用。在利用光能自养的光合细菌和植物中，HPPD除了能够参与酪氨酸分解代谢外，还是植物体中质体醌和生育酚生物合成途径的关键酶[4] ，其催化生成的尿黑酸参与质体醌和生育酚的合成。
3国内外研究概况
近年来，科学家们已经克隆表达出不同来源的微生物和植物的基因hppd [57]，来自动植物、某些细菌的HPPD蛋白质晶体结构已被解析，HPPD和底物的作用机制以及酶和抑制剂类除草剂的作用方式[4]也相继被报道。但是，苞卫的抗性基因hppd目前尚未被报道。总的来说，使植物具有HPPD抑制剂（包括抑制型的除草剂）抗性大致可以分为以下几种方法：转基因作物超量表达外源的hppd基因[8]；绕过HPPD通路，由三个替代酶（羟苯基丙酮酸氧化酶、羟基化酶、基团转移酶）催化HPP转化成HGA[9]；增强HPPD底物的竞争抑制水平，阻止抑制剂与酶的结合[10]。但这些方法都没有使转基因植物获得良好的抗性。
4本研究的目的和意义
虽然苞卫性能优良、对人类安全性高，但其是一种选择性除草剂，这种选择性是由敏感和非敏感植物对除草剂的吸收、代谢能力的不同决定的[11]，因此苞卫适用的作物种类较少。目前已有HPPD转基因植物的报道，并且转基因植物对除草剂表现出了一定的抗性[12]，这也为我们的实验开展提供了一定的参考。
苞卫抗性基因 hppd的筛选和应用还没有报道，因此我们从这个角度展开研究，希望能够筛选分离到苞卫的抗性菌株，这对于苞卫高抗菌株突变体的获得以及利用转基因的技术手段构建抗性植株，扩大除草剂的除草谱具有重要的意义。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 样品
从南京中山陵茶园采集的土样。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1 材料与方法 2
1．1 实验材料 2
1．1．1 样品 2
1．1．2 试剂 2
1．1．3 培养基 3
1．1．4 仪器设备 3
1．2 实验方法 3
1．2．1 抗性菌株的分离与筛选 3
1．2．2 分离菌株的抗性比较 3
1．2．3 抗性菌株分类地位的鉴定 3
1．2．3. 1 细菌总DNA的提取 3
1．2．3. 2 16S rRNA 基因序列的扩增 4
1．2．3. 3 系统发育分析 4
1．2．4 菌株BK的生物学特性分析 4
1．2．4. 1 细胞形态学分析 4
1．2．4.2 最适生长温度和pH实验 4
1．2．4.3 菌体的抗性强度 4
1．2．5 菌株BK的驯化 5
2 结果与分析 5
2．1 苞卫抗性菌株的分离与筛选 5
2．2 分离菌株的抗性比较 5
2． *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
3 抗性菌株分类地位的鉴定 5
2．4 菌株BK的生物学特性分析 6
2．4．1 细胞形态学分析 6
2．4．2 最适生长温度和pH实验 7
2．4．3 菌体的抗性强度 7
2．5 菌株BK的驯化 8
3 讨论 8
致谢 9
参考文献： 10
苞卫抗性菌Burkholderia sp. BK的分离、鉴定及其菌体抗性的研究
引言
引言
1苞卫除草剂的简介及其作用机理
苞卫是于2009年被巴斯夫（德国）有限公司推出的一种苯甲酯吡唑酮类除草剂[1]。该药具有除草效率高、对玉米生长安全等特点，对耐草甘膦（氨基酸类），三嗪类，磺酰脲类、芳氧苯氧丙酸类以及咪唑啉酮类除草剂的杂草有很好的防除效果，尤其对玉米田地中的一年生禾本科和阔叶杂草作用显著。相比于草甘膦等非选择性除草剂，该除草剂对作物特异性高，且性能优良，安全性高，因而在农业上应用广泛[2]。苞卫能够竞争性抑制对羟苯基丙酮酸双氧化酶（HPPD）的活性，使机体内质体醌和生育酚的生物合成过程受阻，进而抑制植物体内类胡萝卜素的合成，干扰叶绿体的生成和生理功能，使发芽的植物呈现白化症状[3]。
2对羟苯基丙酮酸双氧化酶（phydroxyphenylpyruvate dioxygenase, HPPD）
HPPD是继PPO和AHAS之后发现的又一重要的除草剂靶标，受三酮类、吡唑类和异噁唑类除草剂的竞争抑制作用。HPPD是一种含有二价铁的α酮酸依赖型的双加氧酶，几乎存在于所有需氧生物的体内。在生物体的L酪氨酸分解代谢中，酪氨酸首先在酪氨酸氨基转移酶的催化作用下转化为对羟苯基丙酮酸（HPP），HPP继续在HPPD的催化下氧化脱羧形成尿黑酸（HGA）；尿黑酸经过一系列酶的催化作用最终形成乙酰乙酸和延胡索酸进入三羧酸循环被生物体利用。在利用光能自养的光合细菌和植物中，HPPD除了能够参与酪氨酸分解代谢外，还是植物体中质体醌和生育酚生物合成途径的关键酶[4] ，其催化生成的尿黑酸参与质体醌和生育酚的合成。
3国内外研究概况
近年来，科学家们已经克隆表达出不同来源的微生物和植物的基因hppd [57]，来自动植物、某些细菌的HPPD蛋白质晶体结构已被解析，HPPD和底物的作用机制以及酶和抑制剂类除草剂的作用方式[4]也相继被报道。但是，苞卫的抗性基因hppd目前尚未被报道。总的来说，使植物具有HPPD抑制剂（包括抑制型的除草剂）抗性大致可以分为以下几种方法：转基因作物超量表达外源的hppd基因[8]；绕过HPPD通路，由三个替代酶（羟苯基丙酮酸氧化酶、羟基化酶、基团转移酶）催化HPP转化成HGA[9]；增强HPPD底物的竞争抑制水平，阻止抑制剂与酶的结合[10]。但这些方法都没有使转基因植物获得良好的抗性。
4本研究的目的和意义
虽然苞卫性能优良、对人类安全性高，但其是一种选择性除草剂，这种选择性是由敏感和非敏感植物对除草剂的吸收、代谢能力的不同决定的[11]，因此苞卫适用的作物种类较少。目前已有HPPD转基因植物的报道，并且转基因植物对除草剂表现出了一定的抗性[12]，这也为我们的实验开展提供了一定的参考。
苞卫抗性基因 hppd的筛选和应用还没有报道，因此我们从这个角度展开研究，希望能够筛选分离到苞卫的抗性菌株，这对于苞卫高抗菌株突变体的获得以及利用转基因的技术手段构建抗性植株，扩大除草剂的除草谱具有重要的意义。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 样品
从南京中山陵茶园采集的土样。
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