保护性耕作对纤维素降解菌群落的影响
：免耕和秸秆还田是可持续农业的关键技术，研究其对土壤纤维素降解细菌群落的影响对于土壤管理具有重要意义。我们在河南省封丘农业生态国家试验站设置了耕作秸秆还田（CntWtS）、免耕秸秆还田(CntWntS)、耕作秸秆不还田(CntWt)和免耕秸秆不还田(CntWnt)四种处理，采用了PCR-RFLP技术和冗余分析来研究保护性耕作对纤维素降解细菌群落结构的影响。结果表明，保护性耕作能提高土壤中纤维素降解细菌数量及多样性，改变纤维素降解细菌群落结构。本实验测得纤维素降解细菌多样性指数CntWntS> CntWtS> CntWnt> CntWt，四种处理土壤共有属为Sinorhizobium、Promicromonosporaceae和Microbacteriaceae，CntWtS和CntWntS独有属分别为Pseudomonas和 Aeromonas、Paenibacillus、Pedobacter，纤维素降解细菌分属为Proteobacteria、Firmicutes 、Actinobacteria和Bacteroidetes门。冗余分析显示四种处理使纤维素降解细菌群落结构发生了较大变化，Rhizobium和Promicromonosporaceae与速效磷呈正相关性，Sphingobium与速效磷和全磷呈负相关性。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 材料与方法2
1.1 材料2
1.1.1采样区概况2
1.1.2长期试验设计与样品采集2
1.1.3仪器与试剂3
1.2方法3
1.2.1土壤理化性质测定3
1.2.2传统稀释平板涂布法计数3
1.2.3纤维素降解菌筛选与计数3
1.2.4纤维素降解菌PCRRFLP分析3
1.2.4.1 细菌16SrDNA扩增3
1.2.4.2 PCR产物回收4
1.2.4.3 PCR产物限制性内切酶酶切4
1.2.4.4 酶切产物电泳分析4
1.2.4.5 E.coli DH5α普通感受态细胞的制备5
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
/> 1.2.4.6 PCR产物的TA克隆5
1.2.4.7 普通感受态细胞酶连产物转化5
1.2.4.8 阳性克隆子验证5
1.2.4.9纤维素降解菌文库数据统计与分析5
1.2.4.10 群落结构多样性评价指数的计算方法5
1.2.4.11 序列测定及系统发育树的构建6
2结果与分析6
2.1 土壤理化性质6
2.2土壤细菌、放线菌和纤维素降解菌计数7
2.3土壤纤维素降解菌目的基因扩增8
2.4 纤维素降解菌基因文库酶切类型统计分析8
2.5 纤维素降解菌基因文库库容分析9
2.6纤维素降解菌基因文库多样性指数分析10
2.7纤维素降解菌基因测序分析和系统发育分析10
2.8环境因子与土壤纤维素降解菌群落结构分布关系的冗余分析12
3 讨论12
4 结论13
致谢13
参考文献13
保护性耕作对纤维素降解菌群落的影响
引言
土壤微生物对生存微环境特别敏感，耕作方式和秸秆还田对其有很大影响[12]，其群落结构变化能反映生态机制与环境胁迫[34]。例如长期对土壤进行不合理的耕作，就会改变土壤物理、化学以及生物性质，影响耕作质量以及生态环境[56]。而适宜的管理措施能够增加土壤微生物种群数量，提高土壤质量，进而提高作物产量[78]。免耕和秸秆还田是可持续农业的关键技术，免耕能够减少土壤结构的破坏，增加底物丰度和均匀度，提高底物利用率和底物利用多样性[9]。已有研究表明，秸秆覆盖还田提高了土壤有机质含量，促进了团聚体的形成，创造出更稳定的微环境，进而增加微生物活性与多样性 [1013]。还有研究指出，腐熟秸秆有利于维持土壤微生物的多样性及活性[14]。
微生物碳可以用来估算土壤的健康和质量，碳循环微生物尤其是纤维素降解菌能分解有机物，在土壤物质循环中起着关键作用。纤维素降解细菌有生长速率高、耐受性能好的特性[15]，并且能够分泌纤维小体到胞外，这种纤维小体包含多种纤维素酶和半纤维素酶，能高效水解纤维素[16]，研究其多样性对土壤碳循环具有重要意义。然而细菌纤维素酶基因家族众多[1718]，难以采用通用的保守引物来扩增功能基因，因此其多样性研究报道并不多。此外研究已表明秸秆可以为土壤微生物活动提供碳源，但是否能改变微生物群落结构或提高纤维素降解细菌群落的物种丰富度、优势度仍存在争议。短期的秸秆还田可能会降低微生物利用碳源的能力以及群落物种的均匀度，造成土壤碳、氮利用下降，但长期的效应能否增加微生物的多样性与活性，仍值得研究。本研究采用PCRRFLP技术来分析长期免耕与秸秆还田土壤中纤维素降解细菌群落结构的多样性，以期为黄淮海平原保护性耕作研究及示范推广提供理论根据。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 采样区概况
保护性耕作长期试验地点在河南省封丘县的中国科学院农业生态试验站内，为半干旱半湿润的温暖带大陆季风气候，年平均气温13.9℃；年平均降雨量615 mm，主要集中在7～9月；无霜期214天；供试土壤为典型潮土和沙壤土壤，耕作制度为冬小麦夏玉米轮作，其土壤类型与耕作制度在黄淮海平原具有典型代表性。
1．1．2 长期试验设计与样品采集
试验始于2006年，实行轮作制。共设4个处理（表11），每个处理4个重复。耕作方式分别为免耕(NT)和翻耕（T）;秸秆处理方式分别为秸秆还田和秸秆不还田，免耕处理时待作物幼苗长出后将其覆盖在地表；翻耕处理时直接撒在地表，播种前翻地混入土中。每个小区面积为14 m×6.5 m,是长方形平面，以便播种与收获。在2013年12月，在每个小区随机选取5个采样点，分别取表层0～10 cm(ULayer)和10～20 cm(DLayer)土壤混合样，带回实验室于4℃和20℃保存备用。
表11 试验设计
Table 11 Designing of the experiment
处理代号
Treatment code
试验处理
Experimental treatments
CntWtS
CntWntS
CntWt
CntWnt
玉米播种前免耕、小麦播种前耕作，秸秆粉碎覆盖还田
玉米、小麦播种前均免耕，秸秆粉碎还田
玉米播种前免耕，小麦播种前耕作，秸秆不还田（常规耕作模式）
玉米、小麦播种前均免耕，秸秆不还田
注：C，玉米；W,小麦；t，耕作；nt，免耕；S,秸秆覆盖还田
Note:C,Corn;W,Wheat;t,Tillage;nt,Notillage;S,Straw mulching
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 材料与方法2
1.1 材料2
1.1.1采样区概况2
1.1.2长期试验设计与样品采集2
1.1.3仪器与试剂3
1.2方法3
1.2.1土壤理化性质测定3
1.2.2传统稀释平板涂布法计数3
1.2.3纤维素降解菌筛选与计数3
1.2.4纤维素降解菌PCRRFLP分析3
1.2.4.1 细菌16SrDNA扩增3
1.2.4.2 PCR产物回收4
1.2.4.3 PCR产物限制性内切酶酶切4
1.2.4.4 酶切产物电泳分析4
1.2.4.5 E.coli DH5α普通感受态细胞的制备5
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
/> 1.2.4.6 PCR产物的TA克隆5
1.2.4.7 普通感受态细胞酶连产物转化5
1.2.4.8 阳性克隆子验证5
1.2.4.9纤维素降解菌文库数据统计与分析5
1.2.4.10 群落结构多样性评价指数的计算方法5
1.2.4.11 序列测定及系统发育树的构建6
2结果与分析6
2.1 土壤理化性质6
2.2土壤细菌、放线菌和纤维素降解菌计数7
2.3土壤纤维素降解菌目的基因扩增8
2.4 纤维素降解菌基因文库酶切类型统计分析8
2.5 纤维素降解菌基因文库库容分析9
2.6纤维素降解菌基因文库多样性指数分析10
2.7纤维素降解菌基因测序分析和系统发育分析10
2.8环境因子与土壤纤维素降解菌群落结构分布关系的冗余分析12
3 讨论12
4 结论13
致谢13
参考文献13
保护性耕作对纤维素降解菌群落的影响
引言
土壤微生物对生存微环境特别敏感，耕作方式和秸秆还田对其有很大影响[12]，其群落结构变化能反映生态机制与环境胁迫[34]。例如长期对土壤进行不合理的耕作，就会改变土壤物理、化学以及生物性质，影响耕作质量以及生态环境[56]。而适宜的管理措施能够增加土壤微生物种群数量，提高土壤质量，进而提高作物产量[78]。免耕和秸秆还田是可持续农业的关键技术，免耕能够减少土壤结构的破坏，增加底物丰度和均匀度，提高底物利用率和底物利用多样性[9]。已有研究表明，秸秆覆盖还田提高了土壤有机质含量，促进了团聚体的形成，创造出更稳定的微环境，进而增加微生物活性与多样性 [1013]。还有研究指出，腐熟秸秆有利于维持土壤微生物的多样性及活性[14]。
微生物碳可以用来估算土壤的健康和质量，碳循环微生物尤其是纤维素降解菌能分解有机物，在土壤物质循环中起着关键作用。纤维素降解细菌有生长速率高、耐受性能好的特性[15]，并且能够分泌纤维小体到胞外，这种纤维小体包含多种纤维素酶和半纤维素酶，能高效水解纤维素[16]，研究其多样性对土壤碳循环具有重要意义。然而细菌纤维素酶基因家族众多[1718]，难以采用通用的保守引物来扩增功能基因，因此其多样性研究报道并不多。此外研究已表明秸秆可以为土壤微生物活动提供碳源，但是否能改变微生物群落结构或提高纤维素降解细菌群落的物种丰富度、优势度仍存在争议。短期的秸秆还田可能会降低微生物利用碳源的能力以及群落物种的均匀度，造成土壤碳、氮利用下降，但长期的效应能否增加微生物的多样性与活性，仍值得研究。本研究采用PCRRFLP技术来分析长期免耕与秸秆还田土壤中纤维素降解细菌群落结构的多样性，以期为黄淮海平原保护性耕作研究及示范推广提供理论根据。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 采样区概况
保护性耕作长期试验地点在河南省封丘县的中国科学院农业生态试验站内，为半干旱半湿润的温暖带大陆季风气候，年平均气温13.9℃；年平均降雨量615 mm，主要集中在7～9月；无霜期214天；供试土壤为典型潮土和沙壤土壤，耕作制度为冬小麦夏玉米轮作，其土壤类型与耕作制度在黄淮海平原具有典型代表性。
1．1．2 长期试验设计与样品采集
试验始于2006年，实行轮作制。共设4个处理（表11），每个处理4个重复。耕作方式分别为免耕(NT)和翻耕（T）;秸秆处理方式分别为秸秆还田和秸秆不还田，免耕处理时待作物幼苗长出后将其覆盖在地表；翻耕处理时直接撒在地表，播种前翻地混入土中。每个小区面积为14 m×6.5 m,是长方形平面，以便播种与收获。在2013年12月，在每个小区随机选取5个采样点，分别取表层0～10 cm(ULayer)和10～20 cm(DLayer)土壤混合样，带回实验室于4℃和20℃保存备用。
表11 试验设计
Table 11 Designing of the experiment
处理代号
Treatment code
试验处理
Experimental treatments
CntWtS
CntWntS
CntWt
CntWnt
玉米播种前免耕、小麦播种前耕作，秸秆粉碎覆盖还田
玉米、小麦播种前均免耕，秸秆粉碎还田
玉米播种前免耕，小麦播种前耕作，秸秆不还田（常规耕作模式）
玉米、小麦播种前均免耕，秸秆不还田
注：C，玉米；W,小麦；t，耕作；nt，免耕；S,秸秆覆盖还田
Note:C,Corn;W,Wheat;t,Tillage;nt,Notillage;S,Straw mulching
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